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背景与目的黑色素瘤是一种恶性程度极高的肿瘤,早期转移和复发是其死亡的主要原因,预防转移是降低黑色素瘤死亡率的关键。上皮-间质转化(EMT)是肿瘤恶性进展形成转移的关键过程,多种分子参与EMT的调节。表观遗传学信号通路涉及多种肿瘤的发生和发展,组蛋白乙酰基转移酶3(HDAC3)参与多种类型肿瘤(胆管癌、胰腺癌、结肠癌)的发生,但HDAC3在黑色素瘤的发生发展中的作用机制还不是很明确。前期文献证明HDAC3在恶性黑色素瘤转移性淋巴结组织中表达升高,且HDAC3能通过去乙酰化p53来促进恶性黑色素瘤的增殖;这里我们应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275研究发现其能同时降低HDAC3和FUT7的蛋白水平,随后我们通过过表达HDAC3质粒验证了HDAC3能通过影响FUT7的m RNA及蛋白质水平表达来增加恶性黑色素瘤细胞的上皮间质化(EMT)能力;文献研究证明GATA3通过与FUT7基因组结合来调节其转录活性,我们研究发现在黑色素瘤细胞中HDAC3能与GATA3相互作用,且通过影响GATA3的乙酰化水平来调节GATA3的蛋白质水平而不影响其m RNA水平。本研究中我们的结果表明在恶性黑色素瘤细胞中HDAC3能通过去乙酰化GATA3来调节FUT7的基因及蛋白水平的表达,从而影响黑色素瘤细胞的EMT能力,为HDAC3能成为黑色素瘤治疗靶点提供初步理论依据。方法:1.用不同浓度(0、5、10、和20μM)组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275处理人黑色素瘤细胞A375P和鼠源黑色素瘤细胞B16,48小时后收集蛋白,用Western blot检测MS-275对HDAC3和FUT7的蛋白质表达影响。2.用Lipo 2000在体外给人黑色素瘤细胞A375P和鼠源性黑色素瘤细胞B16瞬时转染入Vector或HDAC3 c DNA上调HDAC3,用Real-time PCR、Westernblot验证瞬时转染效率,Real-time PCR、Western blot及免疫荧光检测上调HDAC3后对黑色素瘤细胞EMT相关蛋白(N-cadherin、E-cadherin、Vimentin和Snai)的影响。3.用Lipo 2000将FUT7 c DNA瞬时转染入人黑色素瘤细胞A375P中上调FUT7,用Real-time PCR、Westernblot验证瞬时转染效率,用Real-time PCR、Western blot及免疫荧光检测上调FUT7后对黑色素瘤细胞EMT相关蛋白(N-cadherin、E-cadherin、Vimentin和Snai)的影响。4.用Lipo2000将Vector或HDAC3 c DNA瞬时转染入人黑色素瘤细胞A375P和鼠源性黑色素瘤细胞B16中上调HDAC3,用Real-time PCR、Western blot及免疫荧光检测上调HDAC3后分别对黑色素瘤细胞中FUT7和GATA3的m RNA和蛋白质水平的影响。5.用Lipo2000在体外给A375P细胞转染Vector或HDAC3 c DNA或Si FUT7或HDAC3 c DNA和Si FUT7双转染处理,用Western blot检测与EMT相关的标记蛋白质N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表达变化。6.分别收集A375P、C8161、SK-MEL28和B16四种恶性黑素瘤细胞的蛋白质,用免疫共沉淀和Western blot实验检测HDAC3和GATA3在细胞内的相互作用情况。用Lipo 2000在体外给鼠源性黑色素瘤细胞B16瞬时转染入Vector或HDAC3c DNA上调HDAC3,免疫共沉淀和Western blot实验检测上调HDAC3后对GATA3的乙酰化和泛素化水平的影响。7.用不同浓度(0、2.5、5、和10μM)蛋白酶体抑制剂MG-132处理6小时或瞬时转染HDAC3 c DNA后应用5μM浓度MG-132处理A375P和B16细胞6小时,用Western blot检测MG-132对GATA3的蛋白质表达影响。结果:1.在HDAC3 c DNA转染组中N-cadherin、Vimentin和Snail的m RNA和蛋白质水平表达都升高,E-cadherin的m RNA和蛋白质水平表达降低。2.在黑色素瘤细胞中,组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275能同时降低HDAC3和FUT7的蛋白表达,并具有一定的浓度依赖性。3.在FUT7 c DNA转染组中N-cadherin、Vimentin和Snail的m RNA和蛋白质水平表达都升高,E-cadherin的m RNA和蛋白质水平表达降低。4.在HDAC3 c DNA转染组中FUT7的m RNA和蛋白质水平表达都升高,GATA3的m RNA水平表达基本不变,而GATA3的蛋白质水平表达降低。5.在HDAC3 c DNA转染组中N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白质水平表达都升高,E-cadherin的蛋白质水平表达降低,在Si FUT7转染组中N-cadherin和Vimentin的蛋白质水平表达都降低,E-cadherin的蛋白质水平表达升高,在HDAC3c DNA和Si FUT7双转染处理组能反转HDAC3 c DNA组对N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的蛋白质表达水平。6.在A375P、C8161、SK-MEL28和B16四种恶性黑素瘤细胞中GATA3能与HDAC3相互作用。7.在HDAC3 c DNA转染组中GATA3的乙酰化水平降低,而泛素化水平增加。结论:1.HDAC3能促进恶性黑色素瘤细胞上皮-间质转化(EMT)能力。2.HDAC3能通过影响FUT7的m RNA及蛋白质水平表达来增加恶性黑色素瘤细胞的上皮-间质化(EMT)能力。3.在恶性黑色素瘤细胞中,HDAC3能与GATA3相互结合作用,并通过去乙酰化GATA3来降低其蛋白质水平,从而影响FUT7的表达。