本研究根据genbank中公布的烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus,TRSV)5个分离物的外壳蛋白全序列设计3对特异性引物,建立了烟草环斑病毒分子生物学(包括RT-PCR、巢式PCR、实时荧光RT-PCR)检测体系,研究了每对引物的特异性,通过提纯的TRSV粗提液进行灵敏度试验,并与双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、胶体金免疫试纸条法(CGIS)检测的灵敏度进行比较研究。结果表明:所设计引物的特异性好,均不与同属其他种病毒发生交叉反应;在进行灵敏度试验时,DAS-ELISA、CGIS最低检测量分别为100ng和200ng,TRSV-F/R-1的RT-PCR最低检测量10ng,TRSV-F/R-2的RT-PCR最低检测量1ng,巢式PCR与实时荧光RT-PCR当病毒含量只有100pg时仍可检测到。在引物TRSV-F/R-1上分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,以接种在白肋烟上的TRSV为模板,扩增出744bp的TRSV外壳蛋白(TRSV-CP)基因,并将其克隆到PMD-18T载体上,提取质粒进行酶切,得到的TRSV-CP基因再重组到原核表达载体pET-28a中,通过菌落PCR、酶切鉴定及序列测定。结果表明,重组质粒pET-TRSV连接区域符合设计要求,具有正确的开放阅读框架,插入片段含有编码248个氨基酸的完整编码区,推测该段氨基酸序列与报道的TRSV外壳蛋白序列的同源性最高达99.2%。重组表达载体导入宿主菌BL2(1DE3),以终浓度为0.4mM /L的IPTG诱导,37℃培养4h后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到34kDa的目的蛋白。大量诱导蛋白表达,并经过Ni+-NTA纯化,纯化后的蛋白经Western blot分析,再次证明所得的蛋白就是TRSV的外壳蛋白,并且具有免疫学活性。以纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备了多抗血清。ELISA结果表明,免疫的1号和2号两只新西兰大白兔多抗血清与重组蛋白发生很好的抗原抗体反应,效价分别为409600和819200,特异性较好,为开发TRSV血清检测试剂盒打下基础。