现代治疗已明显地改善了肿瘤的预后，但还存在毒副作用以及部分病人治疗无效等问题。基因治疗为肿瘤治疗开辟了新的领域，自杀基因编码的前药代谢酶能将无毒的前药转化成细胞致死性的药物，将自杀基因转入肿瘤细胞就可用前药来特异性杀伤肿瘤细胞。目前有希望进入临床应用的自杀基因为数不多，寻找更有效的自杀基因对提高治疗效果有着重要意义。本实验通过构建含红色酵母R.gracilis D-氨基酸氧化酶(RG-DAAO)cDNA的逆转录病毒载体，以高成瘤性白血病细胞系K562e为靶细胞，探讨DAAO在体内外杀伤白血病细胞的效果和机制，为DAAO基因治疗肿瘤提供实验依据。 DAAO基因重组逆转录病毒载体的构建及K562e细胞转染 用BamHI酶切，凝胶电泳纯化回收，得到线性化载体pLSN片段，经去磷酸化处理后，与PCR扩增DAAO cDNA片段连接，经筛选、酶切鉴定后得到含DAAO基因的逆转录病毒载体pLDAAOSN。pLDAAOSN及另一带绿荧光蛋白基因的重组逆转录病毒载体pLDfG分别转染包装细胞ΦXNA，获得具有感染能力的逆转录病毒，其滴度约为5.2×106CFU／ml，并将所携带的目的基因DAAO转移至高成瘤性人白血病细胞系K562e中获得KDMo、KDfGc、KDfOd等三株表达DAAO基因的K562e克隆，KDaaO、KD0ac、KD0aa细胞经多次传代、冻存、复苏后进行基因组DNA检测、DAAO mRNA原位杂交及细胞毒性试验，均表明DAAO基因已稳定整合至KDMo、KD臆c、KDmd细胞基因组中并表达。 D-Ala对转DAAO基因的K562e细胞的杀伤效应及机制 通过细胞形态、活细胞计数观察细胞生物学特性，应用MTT法检测D-Ala对KDMo、KD0a~、KD0ad、不同比例DAAO’与DAAO’的混合细胞杀伤作用。用酚红氧化法测定培养上清H2O2。结果表明，转基因细胞与K562e生长速度无显著差异。转基因细胞在D-丙氨酸作用下形态改变，通过MTT法检测其OD值，显示D-Ala作用24小时后KDMo、KDfoc、KDfm细胞的IC50与K562e相差约3～10倍，有统计学意义，表明转基因细胞对D-Ala敏感性明显高于对照的K562e。同样浓度的D-Ala延长作用时间至48小时，没有明显提高IC50。D-丙氨酸杀伤转基因细胞的作用有明显的阈值性，达到一定有效浓度杀伤效率明显提高。培养上清中的H2O2浓度与转基因细 第二军医大学博士毕业论文 中文槽耍 血液学专业 胞杀伤作用一致。结果还显示Koroc与不同比例的K562e混合时，杀死细胞比例 不能超过K。nc的比例，提示旁观者效应不明显。 D－la对转DAAO基因的K562e细胞移植瘤的杀伤效应 将Koroc和 K562e细胞分别接种于棵鼠一侧前后肢皮下，建立移植性人白血病细胞肿瘤模 型，并用D－Ala治疗3周。结果表明，治疗组K562e的瘤重是Koroc的2．44倍 O＜0刀1卜对照组K562C的瘤重是KDfGc的1．2倍b＞0．05入表明转基因细胞对 D－Ala作用敏感。病理检查发现转基因治疗的瘤组织出现坏死，呈散在性分布， 大都围绕血管，提示是药物治疗作用的结果。K562e组及对照组的瘤组织也有部 分坏死，主要位于肿瘤中心，而且无血管分布，提示是缺血性坏死。心、肝、肾 等重要脏器两组均无明显损害。 结论：1．构建含DAAO基因的重组逆转录病毒载体，将DAAO基因转移 至高成瘤性白血病细胞K562e中；2．D－Ala对转有DAAO基因的白血病细胞 ＊562e具有特异的杀伤作用：3．＊－＊la对转＊AA O基因细胞的杀伤作用与＊－＊la 的浓度明显相关，呈浓度依赖的阈值性，24－48 ，J’时达到最大作用；4．D－Ala杀 伤转DAAO基因细胞是通过HZOZ介导的；5．DAAO／D－A18系统对高成瘤白血 病细胞移植瘤有明显的治疗效果，并对重要脏器无明显损伤。