非生物逆境是作物产量的主要制约因素。现代分子生物学手段现已广泛应用于育种研究,并获得不少具有优良耐逆能力的作物新品种。类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-like proteins, CBL)是一类重要的钙信号受体蛋白,在非生物胁迫应答反应中具有重要作用,主要通过与CBL相互作用蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases, CIPK)相互作用将信号向下游传递。拟南芥中CBL和CIPK家族成员在耐逆中的作用已有较深入的研究,其中AtSOS3(CBL4)和AtCIPK24(SOS2)是SOS途径的两个关键组分,在植物盐胁迫应答中发挥重要作用。但是小麦中CBL和CIPK家族成员功能以及是否存在SOS途径还不清楚,SOS途径在植物中是否具有保守性和通用性还未见报道。本研究基于以上科学问题,利用生物信息学方法系统分析了小麦CBL和CIPK基因家族,从本室培育的小麦渐渗系耐盐品种山融3号(SR3)中克隆了一系列TaCBLs和TaCIPKs基因,并初步验证了TaCBL4、TaCBL3在非生物胁迫应答中的功能。一、小麦CBL和CIPK的生物信息学分析和新基因克隆通过生物信息学分析,电子克隆了14个小麦CBL家族成员和34个小麦CIPK家族成员。多序列比对及进化树分析显示,这些TaCBLs在大小和结构上非常保守,其中5个具有豆蔻酰化位点,2个具有跨膜疏水区,暗示这7个TaCBLs在抗逆中发挥重要作用。TaCIPKs间序列差异比较大,但结构十分保守。SR3中TaCIPKs间也存在差异,这可能与基因倍增过程相关。进化树分析显示,小麦中TaCBLs和TaCIPKs都存在许多旁系同源基因,并且它们与水稻中同源基因的相似性高于拟南芥。将这些电子克隆的TaCIPK基因与实验室定制的小麦cDNA芯片探针进行比对,以分析它们的盐胁迫应答特征。结果发现,8个TaCIPKs在芯片中有特异性匹配探针,其中4个为盐诱导表达基因,4个盐下调表达基因：另外,芯片中有3个探针分别对应多个TaCIPK序列,而且这3个探针在盐胁迫24h后表达量都显著提高。这些盐胁迫应答的TaCIPKs(?)可能都参与植物的盐胁迫应答反应,其功能需要进一步研究。根据电子克隆序列,从SR3中克隆3个TaCBL和9个TaCIPK新基因,按照与拟南芥CBLs的同源性,分别命名为TaCBL1/3/4和TaC1PK2/8/11/15/17/19/30/32/34。 TaClPKs中,TaCIPK8、TaCIPK15在盐胁迫下上调表达,TaCIPK11下调表达,其他基因的应答模式有待进一步验证,为耐盐候选基因的鉴定及TaCBL互作蛋白的筛选奠定了基础。二、小麦TaCBL4和TaCBL3功能分析1、TaCBL4结构与可能作用分析TaCBL4有7个内含子,其编码产物定位于细胞膜,与拟南芥同源基因AtSOS3(CBL4)相似,是AtSOS3同源基因。TaCBL4在小麦的根、叶、茎、幼穗、麦芒、幼胚、旗叶等组织中均能表达,NaCl(?)协迫下其表达量明显增加,表明TaCBL4在小麦生长发育和盐胁迫应答过程中均发挥重要作用。为了验证TaCBL4(?)的生物学功能及其与AtSOS3(?)的异同,将其在拟南芥Col-0野生型和sos3突变体中异源表达,观察表型变化,并用AtSOS3在拟南芥中的过表达系作为对照。TaCBL4过表达不影响拟南芥的营养和生殖生长。在1/2MS培养基中,Col-0(WT)、TaCBL4过表达野生型系(OE)、TaCBL4过表达sos3(sOE)幼苗根长和地上部分无显著性差异。NaCl胁迫下,与WT相比,sos3幼苗的主根更短、地上部分漂白程度高,与朱建康实验室结果一致；而OE系和sOE系幼苗根与WT没有显著差别,但是叶片显著变小。这显示,TaCBL4能够恢复sos3根的表型,但首次发现OE系和sOE系在胁迫下抑制叶生长。LiCl胁迫下,与WT相比,sos3幼苗的主根明显变短、地上部分变小,而OH系、sOE系及AtSOS3过表达系幼苗正好相反,主根更长、地上部分更大,首次表明TaCBL4和AtSOS3过表达可以提高幼苗期锂离子胁迫抗性。在ABA处理和渗透胁迫下不同株系无明显差异,表明TaCBL4是一个离子特异性响应基因。相比植株发育,盐胁迫对种子萌发的影响更大。为了分析TaCBL4在这阶段是否发挥重要作用,我们以绿色子叶张开率为标准,比较了不同株系在钠、锂离子胁迫下的萌发率差异。NaCl胁迫下,sos3不萌发,WT萌发率降低,而OE系和sOE萌发率受影响少,萌发率明显比WT高。LiCl处理下,WT和sos3的萌发率降低,基中sos3(?)降低更明显,而OE系和sOE萌发率无显著变化。高盐土壤一般碱性较高,我们发现与WT相比,OE系在盐碱条件下的萌发率明显提高。以上结果显示,TaCBL4和AtSOS3一样,也是钠、锂离子特异性响应基因,并且TaCBLA和AtSOS3在盐胁迫应答中发挥相似的功能,表明小麦中也存在SOS系统,而且不同植物间SOS系统存在保守性和通用性。本实验发现,TaCBL4在小麦抗钠离子育种中应该有针对性地设计在种子萌发阶段特异性表达,而在抗锉离子育种中则不受此限制。有趣的是,低钾条件下,与Col-0相比,OE系和sOE系幼苗的地上部分明显变小,而AtSOS3过表达系则无显著变化,推测TaCBL4可能还调控钾离子通道的活性。这一结果表明,TaCBL4在盐胁迫应答中的作用与钾相关,幼苗阶段TaCBL4降低对Na+的耐性是由于负调控K+的转运引起的,显示了不同物种间SOS系统的特异性。为了进一步认识TaCBL4的作用机制及其与AtSOS3功能的异同,我们利用酵母双杂交方法分离拟南芥中与TaCBL4相互作用的CIPK蛋白。结果发现,TaCBL4能与AtCIPK5/10/11/15/18/21/24这7个CIPKs互作,其中AtCIPK15/24为AtSOS3互作蛋白,而AtCIPK6/7不与TaCBL4互作。推测TaCBL4通过与AtCIPK11相互作用而抑制了后者活性,提高了植株的抗盐碱性,通过AtCIPK24(SOS2)互作而激活SOS通路促进Na+外排。TaCBL4和AtSOS3互作CIPKs种类存在相似性和特异性,而且TaCBL4和AtSOS3对与其共同互作的CIPKs的调控也可能存在差异性,那么这种特异性和差异性是否与TaCBL4过表达导致的低钾敏感型相关,需要进。步研究。2、TaCBL3功能的初步分析TaCBL3与水稻OsCBL6及拟南芥AtCBL2、AtCBL6相似性较高,其编码蛋白定位于液泡膜。离子和渗透胁迫下,TaCBL3过表达拟南芥株系与Col-0无明显差异。缺钾诱导TaCBL3的表达,而且缺钾条件下,与Col-0相比,TaCBL3过表达株系黄化更严重,植株生长抑制程度更显著。这表明,TaCBL3可能是钾离子通道的抑制因子,为植物离子转运机制研究提供了新的基因资源。总之,本论文通过生物信息学和分子生物学方法,系统分析了小麦CBL和CIPK家族成员的序列和表达特征,通过CBL4的功能分析明确了不同物种间SOS通路对高盐、低钾响应存在通用性和特异性,为进一步认识SOS通路调控机制及离子胁迫响应特征奠定了基础,并为培育耐盐、钾营养高效作物新品种提供了分子元件。