[研究目的]肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是一种特殊的供养模式,它的管壁是由肿瘤细胞构成的。VM与肿瘤的临床分期、浸润和转移、患者生存期的缩短有关。Slug是重要的EMT调控因子,它不仅能诱导EMT的发生还能够影响肿瘤干细胞的干细胞特性。肿瘤干细胞可以促进肿瘤血管生成,同时它还具有向内皮细胞分化的能力。然而,到目前为止在HCC中EMT、CSCs和VM三者之间的关系还不是很明确。本研究通过对113例随访资料完整的人类肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)临床病例资料进行分析,研究Slug和E-cadherin、vimentin、VE-cadherin、VEGF、CD90和CD133等之间的关系,分析Slug对HCC复发转移、预后生存、肿瘤干细胞表型表达的影响以及其在肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)中的作用。利用裸鼠模型和HCC细胞系在体内和体外实验中对临床病例资料的结果进行验证。期待能为HCC的治疗提供新的靶点。[研究方法]1、收集天津医科大学总医院和附属肿瘤医院经手术切除标本随访资料完整并经病理诊断为肝细胞肝癌的病例113例,分为Slug阳性组与Slug阴性组,分析Slug与年龄、性别、复发与转移,临床分期之间的关系；运用Kaplan-Meier生存分析比较两组患者的生存预后情况。2、筛选出低表达和高表达Slug的HCC细胞系,构建Slug表达质粒和shRNA质粒,转染细胞获得Slug上调和下调模型,用Western blot鉴定转染效果。利用Transwell侵袭实验评价Slug对细胞迁移和侵袭能力的影响；进一步利用三维培养模型分析Slug在肿瘤细胞血管生成过程中的作用；利用染色质免疫共沉淀和基因芯片分析Slug的调控作用和信号转导通路。3、利用5周龄的雄性BALB/c裸鼠建立动物模型。分为Slug阳性组和Slug阴性组,在每只裸鼠腋下分别注入5X106个HepG2-Slug和HepG2肿瘤细胞。每周测量裸鼠肿瘤的大小并计算肿瘤的体积,成瘤一个月后处死裸鼠。肿瘤体积计算用公式为TV=1/2×axb2(a为肿瘤的长,b为肿瘤的宽)。分析Slug在VM的形成和调节E-cadherin、vimentin、VE-cadherin、VEGF、CD90和CD133等蛋白表达水平中的作用。[结果]1、Slug的表达与VM的形成相关VM是由肿瘤细胞模仿血管壁的结构形成的可输送血液的管道系统,CD31/PAS双染可以观察到肿瘤细胞CD31表达阴性,一层厚薄不一的PAS阳性物质围绕在该管道的结构外周形成类似基底膜样的结构,管道中央有红细胞的存在。113例HCC临床病例样本,发现20例(20/113,17.7%)具有典型的VM结构。寻找热点区域,然后在高倍镜(200x)计数VM的个数,计数5个视野取平均值。Slug阳性组VM计数(4.20±0.80)大于Slug阴性组VM计数(0.18±0.12),两组VM计数之间的差异具有统计学意义(t=6.662,p=0.000)。提示在肝癌病例中Slug表达与VM的形成相关。Slug阳性细胞可以参与形成血管生成拟态或与内皮细胞共同形成马赛克血管,它与肿瘤血管的形成密切相关。Hepatocyte免疫组织化学染色结果显示形成VM的细胞为HCC肿瘤细胞,而且Hepatocyte阳性细胞和Hepatocyte/Slug阳性细胞参与了肿瘤VM的形成。VE-cadherin是公认的VM形成的标志性分子。免疫组织化学染色结果显示,在113例HCC临床病例资料中,VE-cadherin表达的阳性率为42.5%(48/113)。统计学分析表明,Slug的表达与VE-cadherin的表达具有相关性。VEGF表达的阳性率为61.1%(69/113)。Slug阳性组VEGF的表达明显强于Slug阴性组,差异具有统计学意义,相关分析表明Slug的表达与VEGF的表达呈正相关。2、Slug的表达与HCC的转移和患者的预后相关临床病理资料分析结果显示,slug阳性病例(39例)与Slug阴性病例(74例)相比Slug的表达与年龄、性别、临床分期、病理分级等无关,与转移有关。113例HCC临床病例资料中转移组为47例,非转移组为66例。转移组Slug阳性率(22/47,46.8%)高于非转移组Slug阳性率(17/66,25.8%),差异有统计学意义(X2=5.382,p=0.020)。Kaplan-Meier生存分析结果表明在HCC中表达Slug的患者生存期短、预后差,Slug阳性组病人的平均生存时间34.311(95%置信区间：27.084-41.538)较Slug阴性组病人的平均生存时间44.721个月(95%置信区间：38.192-51.251)短,差异具有统计学意义(p=0.025)。3、Slug能够诱导EMT的发生Slug是公认的EMT诱导因子,它可以抑制E-cadherin的表达。免疫组化检测E-cadherin和vimentin的表达并进行统计分析,结果显示Slug的表达与E-cadherin和vimentin的表达密切相关。Slug能够抑制E-cadherin的表达并促进vimentin的表达。免疫组织化学双重染色结果显示Slug阳性细胞其E-cadherin的表达缺失,而Slug阴性细胞的细胞膜则有E-cadherin的表达。4、Slug的表达与肿瘤细胞的干性特征相关CD133和CD90是HCC肿瘤干细胞的标记物。统计学分析表明,Slug的表达与CD90的表达相关(r=0.207,P=0.028)。高表达Slug的患者也高表达CD90(30.8%,12/39),然而低表达Slug的患者只有1.4%(10/74)的患者CD90阳性。这些实验数据提示,Slug的表达和CSCs表面标记分子CD90的表达密切相关。免疫组织化学双重染色结果显示CD90阳性细胞为HCC肿瘤细胞,而且CD90和hepatocyte双阳性的HCC细胞参与了VM的形成。在HCC细胞中,Slug可以和CD90、CD133共表达于同一个肿瘤细胞,CD133和CD90阳性细胞直接参与了VM的形成。提示表达CSCs表面标记物CD133/CD90的HCC肿瘤细胞可以形成VM。免疫组织化学染色方法检测多潜能肿瘤干细胞重编程转录因子sox2,nanog, oct-4的表达情况。阳性细胞均为核着色。113例HCC临床病例资料分析结果显示,SOX2的阳性率为29.2%,Nanog的阳性率为13.3%,HCC几乎不表达OCT4。Slug的表达和SOX2的表达具有相关性(r=0.230, P=0.014),slug的表达同样和nanog的表达密切相关(r=0.210,P=0.026)。研究发现SOX2阳性细胞参与了血管的形成。免疫组织化学双重染色结果显示,Slug可以和SOX2共表达于同一个肿瘤细胞,而且Slug和SOX2共表达的肿瘤细胞参与了VM的形成。在体外和体内实验中,这些实验结果均得到了验证。[结论]1、人HCC中存在VM,VM是肿瘤细胞为适应环境而产生的一种独特的血液供应模式,与内皮依赖性血管并存于肿瘤组织内,且VM结构主要存在于分化差、恶性度高的实体型及低分化型的HCC中,提示这种结构与HCC恶性生物学行为相关。2、EMT调控因子Slug与人HCC肿瘤的转移及VM的形成正相关,与年龄、性别、临床分期、病理分级等无关。它能够影响病人的生存预后。Slug表达阳性的病人生存时间短、预后差。3、Slug的表达与EMT的发生和肿瘤干细胞的形成相关。Slug的表达可以上调SOX2、nanog、CD9(、CD133、VEGF、VE-cadherin、Vimentin等的表达。SOX2和nanog的表达可以使HCC肿瘤细胞重编程成为多潜能肿瘤干细胞。体外和体外实验结果也显示,在HCC肿瘤细胞中Slug可以诱导EMT的发生、促进VM并与肿瘤细胞干性特征形成有关。