研究背景：关节软骨损伤是关节外科常见的问题，常由创伤和多种疾病引起。软骨组织是一种高分化的组织，自我修复能力有限。大的软骨缺损常有纤维软骨修复。这种修复的纤维软骨无论在生物力学还是在生物机制方面，都与正常透明软骨不同，最终发生退变。近年来探索多种方法修复软骨损伤，如关节微创手术，自体或异体组织（骨膜、软骨膜、骨软骨块）移植等。诸多尝试说明在接受关节置换之前尚无公认的有效手段。组织工程软骨移植被认为是修复软骨缺损的较好方法，是未来治疗关节病变实现由置换向重建发展的重要手段之一。组织工程技术可以通过获取自体少量组织细胞，经体外培养扩增后与支架材料复合，构建与病损区形状结构、生物学特性相近的细胞-支架复合体，以修复或替代损伤组织。自体软骨细胞移植是最有前景的方法，但和自体骨软骨移植一样具有供区出现病变的缺点。应用干细胞进行治疗是一个新兴的领域。而最有希望的是成体干细胞，尤其是间充质干细胞。目前，间充质干细胞最常见的来源就是骨髓，但是其细胞获得量很小，需要在体外进行扩增，而且其中还包含大量的造血干细胞。基于应用的需要，理想的细胞来源应该对供区影响较小，容易获得，低免疫源性，细胞量大以减少体外扩增时间。脂肪组织就是这样一个理想的来源。脂肪干细胞具有多向分化潜能，已经被证实的能够向软骨、骨、脂肪以及心肌等组织分化。本研究的目的为评价脂肪干细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。在内容上主要包括三个方面。第一部分主要探讨脂肪干细胞在体外的分离、培养及软骨方向诱导；第二部分主要为体外构建脂肪干细胞／脱细胞软骨基质支架复合体，并在裸鼠体内异位构建组织工程软骨；第三部分主要为细胞支架复合体修复动物骨软骨缺损，并对其结果进行大体上，组织学，生物化学及生物力学评估。方法：（1）无菌状态下从新西兰大白兔皮下脂肪分离脂肪干细胞，加入含有10％FBS的DMEM，在37℃，5％CO₂孵箱中培养。选取第三代脂肪干细胞进行如下处理：（A）普通培养基培养（DMEM，10％FBS）。（B）在DMEM中加入10％FBS，10ng／ml TGF-β1，10ng／ml bFGF，10^-7M地塞米松，作为诱导培养基。（C）以骨髓基质干细胞作为对照。成软骨细胞表型通过蕃红花O染色、阿尔辛兰染色以及Ⅱ型胶原免疫组化进行鉴别。GAG定量检测应用二甲基亚甲兰法，Ⅱ型胶原定量检测通过ELISA法。细胞增值率通过CCK-8检测。（2）脂肪干细胞复合微载体（Cytodex-3）在生物反应器（RCCS）中进行诱导培养。静态诱导培养作为对照。应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的脂肪干细胞进行动态观察，并对收获的脂肪干细胞进行蕃红花O、甲苯胺兰染色等组织化学染色及Ⅱ型胶原的免疫化学染色分析。（3）脂肪干细胞以5×10⁷／mL种植在脱细胞软骨基质支架（直径4mm，厚度2mm）上，置于生物反应器中进行诱导培养，同时设单纯静止培养组作为对照，3周后观测大体形态和组织学形态变化，同时进行组织化学和Ⅱ型胶原免疫组织化学分析。（4）细胞支架复合体在体外应用诱导培养基或普通培养基培养一周，植入裸鼠背部皮下，以诱导的骨髓干细胞作为对照，三周后取材，进行组织学检测。（5）在兔股骨远端髌骨滑车上造一直径4mm全厚关节软骨缺损。分为6组；（A）旷置组。（B）单纯支架组。（C）未诱导脂肪干细胞／支架。（D）诱导脂肪干细胞／支架组。（E）诱导骨髓干细胞／支架组。（F）生物反应器诱导脂肪干细胞／支架组。标本分别在3，6，12月取材获得，从大体，组织学，生物化学及生物力学方面进行评估。结果：两周后脂肪干细胞可获得第三代，而骨髓干要三周时间。没有经过诱导的脂肪干细胞和骨髓干细胞Ⅰ型胶原染色阳性。而经过诱导的两种干细胞Ⅱ型胶原阳性。两种细胞的增殖特性相同。定量分析GAG和Ⅱ型胶原，诱导的脂肪干细胞高于未诱导的，而与诱导的骨髓干细胞相同。在生物反应器中诱导的脂肪干细胞于24h内贴附于Cytodex3微载体表面，细胞形态为短梭形，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的20倍左右，在微载体上收获的细胞进行蕃红花O、阿尔辛兰染色呈阳性，Ⅱ型胶原染色阳性，均强于对照组。在生物反应器中动态培养的细胞／支架复合体的力学强度明显高于对照组，组织学观察支架大部分已被吸收，细胞增殖显著，细胞外有大量基质分泌。蕃红花O、阿尔辛兰染色阳性，Ⅱ型胶原染色阳性，均显著强于静止培养组。经诱导的脂肪干细胞与骨髓干细胞在裸鼠体内均有类软骨形成。在动物实验中，结果显示各组以纤维软骨或透明软骨对缺损均有不同的修复。对缺损修复区进行组织学评分显示生物反应器诱导的脂肪干细胞复合体是最好的一组，诱导的骨髓干和脂肪干细胞次之，要好于其它组，而它们之间不具有明显差异。生物力学及生物化学分析结果是一致的。结论：（1）通过本研究成功建立了脂肪干细胞的分离培养及软骨方向诱导。（2）利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增脂肪干细胞，并成功实现向软骨细胞分化。（3）生物反应器培养明显促进了脂肪干细胞的增殖与软骨分化，是体外构建组织工程软骨的良好方法。（4）研究证实脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架构建的组织工程软骨能够修复动物关节软骨缺损。（5）脂肪干细胞能够作为软骨组织工程的种子细胞，研究证实它具有与骨髓干细胞相同的成软骨潜能。