湿热泄泻(dampness-heat diarrhea,DHD)是中(兽)医临床应用中常见的疾病。白头翁汤(pulsatilla decoction,PD)是中医临床治疗湿热泄泻的经典方剂,对湿热型溃疡性结肠炎有良好的治疗效果。为了探究PD治疗DHD的作用机制,本研究通过建立DHD大鼠模型,运用PD进行治疗。采用临床病理学指标评价PD治疗效果,利用尿液代谢组学方法对DHD模型大鼠不同造模阶段的尿液样本进行机体代谢系统变化探讨,进一步采用血清及尿液代谢组学方法探究PD对DHD模型大鼠内源性代谢物及代谢通路的影响,结合网络药理学方法探讨PD治疗湿DHD的“多成分-多靶点-多通路”的药效作用机制。方法:Wistar大鼠32只,随机分为4组,雌雄各半,每组8只:空白对照组、模型组、自愈组、白头翁汤组。以高糖、高脂饮食,高温湿度环境及腹腔注射大肠杆菌等复杂因素为诱导发病条件,建立DHD大鼠模型;模型建立后用PD进行治疗。观察实验过程中各组大鼠的临床症状、体征变化及肠道组织病理变化;检测各组大鼠的血常规指标以及血清促炎症细胞因子水平。采集DHD模型组高糖高脂阶段、高温高湿阶段、腹腔注射大肠杆菌阶段和空白对照组大鼠尿液样本,运用UPLC-Q/TOF-MS/MS技术进行代谢组学检测,采用Progenesis QI软件进行代谢组学数据预处理,利用MetaboAnalyst对预处理后的数据进行多元统计分析。筛选同时满足差异倍数(Fold change,FC)≥1.2或≤0.8,q-value<0.05以及OPLS-DA模式下的VIP≥1.0的模型组不同造模阶段及空白对照组大鼠尿液的差异代谢物,通过检索HMDB等数据库、热图聚类分析及Venny分析得到DHD模型大鼠不同造模阶段的共有差异代谢物,将筛选的差异代谢物进行相关代谢通路及相对含量变化分析。对空白对照组、模型组、自愈组及白头翁汤组各组大鼠的血清及尿液样本进行代谢轮廓分析,筛选PD治疗DHD的差异代谢物及靶标代谢通路。基于中药系统药理学分析平台筛选PD的主要活性成分、作用靶点及相关疾病,采用Cytoscape软件构建成分-靶点-疾病直接作用网络及STRING构建蛋白质与蛋白质相互作用网络,利用DAVID软件进行基因本体(GO)和作用通路(KEGG)富集分析。结果显示:(1)模型组大鼠的临床症状、体征变化与湿热泄泻临床表现相符,且大鼠机体出现白细胞、红细胞、血红蛋白、中性粒细胞数目、单核细胞数目、淋巴细胞数目、红细胞压积、肿瘤坏死因子-α、白介素(IL)-1β、IL-2和IL-6显著升高(P<0.05),而血小板数目显著降低(P<0.05)及肠道组织炎性细胞浸润、黏膜上皮损伤等多种病理变化。PD可改善其临床症状和体征变化,回调血常规指标及血清促炎症细胞因子水平,缓解肠道组织病理学变化。(2)DHD模型组高糖高脂阶段、高温高湿阶段及腹腔注射大肠杆菌阶段尿液样本中共有的差异代谢物有7种,分别是5-羟基-N-甲酰犬尿氨酸、左旋谷酰基-左旋半胱氨酸、左旋甲酰犬尿氨酸、亚油酸、褪黑素、核黄素-5-磷酸及左旋色氨酸,主要涉及核黄素代谢、色氨酸代谢及亚油酸代谢等代谢通路。高糖高脂阶段:5-羟基-N-甲酰犬尿氨酸、亚油酸、褪黑素及左旋甲酰犬尿氨酸的相对含量显著降低,左旋谷酰基-左旋半胱氨酸、核黄素-5-磷酸及左旋色氨酸显著升高;高温高湿阶段:亚油酸和左旋甲酰犬尿氨酸含量显著升高,左旋谷酰基-左旋半胱氨酸和核黄素-5-磷酸降低;腹腔注射大肠杆菌阶段:左旋甲酰犬尿氨酸、亚油酸及左旋色氨酸含量显著降低,左旋谷酰基-左旋半胱氨酸和核黄素-5-磷酸显著升高。(3)从血清及尿液样本中共筛选得到17种潜在的代谢标志物(血清8种、尿液9种)可能与PD治疗DHD的作用机制相关,经对照品验证血清潜在代谢标志物得到PD干预DHD的血清生物标志物是7-酮基脱氧胆酸、五羟色胺和创伤酸。与空白对照组相比,DHD模型组大鼠7-酮基脱氧胆酸和创伤酸的相对含量显著上升(P<0.05),五羟色胺的相对含量显著下调(P<0.05),经PD治疗后,这些血清生物标志物相对含量回调,且接近空白对照组。通过分析其相关代谢通路,结果显示涉及甘油磷脂代谢、色氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和磷酸戊糖途径等代谢路径,综合分析血清和尿液相关的代谢通路表明PD主要是通过调节机体内甘油磷脂代谢、色氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等代谢路径发挥药效作用。(4)PD复方中有45个活性成分,作用靶点166个及相关疾病343种。“成分-靶点-疾病”网络分析显示PD主要通过槲皮素、β-谷固醇和豆甾醇等活性成分,作用于TP53、JUN、IL6、TNF、VEGFA、FOS、EGF和MAPK1等关键靶点发挥药效作用于多种疾病。GO注释和KEGG通路富集分析显示PD通过调控MAPK1、FOS、CCND1、JUN、BAX、BCL2、GSK3B、TP53、MYC和TGFB1等靶点作用于结肠直肠癌通路及调节IL-4、IL-6、TNF、JUN、RELA、IFNG、IL-1β、IL-1α、STAT1、IL-10、TGFB1和IL-2等靶点作用于炎症性肠病通路。表明PD可以通过“多成分-多靶点-多通路”的作用机制发挥药效起到治疗疾病的作用。结论:(1)PD治疗DHD可能是通过抗炎、增强免疫细胞功能及缓解和保护肠道组织损伤发挥药效作用;(2)DHD机体的发病机理可能是5-羟基-N-甲酰犬尿氨酸、左旋谷酰基-左旋半胱氨酸、左旋甲酰犬尿氨酸、亚油酸、褪黑素、核黄素-5-磷酸和左旋色氨酸等潜在代谢标志物含量变化,影响核黄素代谢、色氨酸代谢和亚油酸代谢通路,造成机体代谢系统紊乱;(3)PD治疗DHD的作用机理是通过调节湿热泄泻机体内血清生物标志物7-酮基脱氧胆酸、五羟色胺和创伤酸的含量,调控血清甘油磷脂代谢、甘油酯代谢、初级胆酸合成及色氨酸代谢通路;(4)PD可以调节DHD机体内尿液潜在代谢标志物的含量,调控谷胱甘肽代谢、色氨酸代谢、磷酸戊糖途径及生物素代谢通路发挥药效作用;(5)PD可以通过槲皮素、β-谷固醇和豆甾醇等活性成分作用于关键靶点TP53、JUN、IL6、TNF、FOS、IFNG、IL-1β、IL-1α、IL-2和MAPK1,调控结肠直肠癌通路和炎症性肠病通路发挥药效治疗DHD,为揭示PD的“多成分-多靶点-多通路-多疾病”相互关联的生物效应机制奠定理论基础。