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脓毒症(sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome, SIRS)，是严重烧伤、创伤的常见并发症，进一步发展可导致多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfuction syndrome, MODS)和脓毒性休克(septicshock)，严重威胁患者生命。革兰阴性菌外膜中的主要成分内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)是脓毒症的主要病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。LPS与其模式识别受体TLR4(Toll like receptor4）结合后可启动MyD88依赖和TRIF/TRAM依赖的两条信号转导通路，活化单核/巨噬细胞，激活炎症因子的转录与释放，导致炎症反应，过度的炎症反应可诱导脓毒症的发生。内化(internalization)是指细胞通过胞吞作用将胞外物质转运入胞内的过程。LPS-TLR4复合物内化入胞进入早期内体，然后通过晚期内体运送至溶酶体降解代谢，这一过程伴随着内体的酸化成熟。近期研究表明，LPS的内化与其对细胞的活化密切相关，本课题组前期研究结果也显示，内化抑制后，LPS刺激巨噬细胞活化的程度明显降低；内体酸化成熟障碍可抑制巨噬细胞的活化，对炎症反应具有抑制作用，但机制尚不明确。同时还观察到CQ预处理抑制内体酸化成熟后内化的LPS-TLR4共定位消失，这与以往的认知相悖，而这一现象与LPS内化和活化细胞的关系及机制不明确。因此，本研究旨在探讨内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制，为进一步深入研究LPS内化与细胞活化的关系及病理生理机制奠定基础。目的应用内体酸化成熟抑制剂氯喹(Chloroquine，CQ)抑制RAW264.7细胞内体酸化成熟，研究内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制。方法1.内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264.7细胞的调控作用的研究(1)CQ(20μg/ml)预处理RAW264.7细胞1h，LPS(100ng/ml)刺激24h后收集细胞培养上清液，ELISA法检测TNF-α和IL-6在蛋白水平的表达情况。(2)采用siRNA技术抑制RAW264.7细胞MyD88、TRAM的表达，LPS(100ng/ml)(3)小鼠炎症细胞因子抗体芯片技术检测CQ预处理及siRNA干扰MyD88、TRAM后细胞上清中炎症介质总体的分泌情况，并进行对比分析。2.内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264.7细胞的调控作用的机制研究(1)CQ预处理后LPS-TLR4复合物共定位消失现象的研究①利用CQ(20μg/ml)及另一内体酸化成熟抑制剂--氯化铵(500μg/ml)抑制RAW264.7细胞内体酸化成熟，FITC-LPS(200ng/ml)刺激1h，激光共聚焦显微镜观察FITC-LPS与Cy3-TLR4在胞内的共定位情况。②CQ(20μg/ml)抑制RAW264.7细胞内体酸化成熟后，6FAM-CpG DNA (100ng/ml)刺激30min，激光共聚焦显微镜观察6FAM-CpG DNA与Cy5-TLR9在胞内的共定位情况。③动态观察内体酸化成熟障碍后LPS与TLR4在胞内的共定位情况TLR4::YFP标记质粒转染HEK293细胞，激光共聚焦显微镜观察。CQ预处理后于不同时相点观察LPS-TLR4的胞内分布情况。④内体酸化成熟障碍对内体循环相关调控分子表达的影响LPS(100ng/ml)刺激CQ(20μg/ml)预处理1h后的RAW264.7细胞，4h后，提取细胞总RNA，Real time PCR法检测内体循环关键分子Rab7b、Rab10、Rab11a在核酸水平的表达情况。(2)内体酸化成熟障碍对炎症负调控分子表达的影响LPS(100ng/ml)刺激CQ预处理1h后的RAW264.7细胞，4h后，提取细胞总RNA，Real time PCR法检测负调控分子A20、Tollip及MyD88s在核酸水平的表达情况。结果1.内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264.7细胞的调控作用的研究(1)CQ预处理1h，LPS刺激后TNF-α和IL-6蛋白水平的表达被显著抑制。(2)siRNA技术抑制RAW264.7细胞MyD88、TRAM的表达后，TNF-α和IL-6的表达均被显著抑制。且MyD88表达抑制时，TNF-α的降低水平较IL-6的更显著，TRAM表达抑制时，IL-6的降低水平较TNF-α的更显著。(3)小鼠炎症因子芯片结果显示CQ预处理后炎症因子的变化与MyD88和TRAM表达被抑制时的变化趋势较一致。2.内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264.7细胞调控作用的机制研究(1)CQ预处理后LPS-TLR4复合物共定位消失现象的研究①CQ及氯化铵预处理抑制RAW264.7细胞内体酸化成熟，FITC-LPS刺激1h后，激光共聚焦显微镜观察发现FITC-LPS与Cy3-TLR4在胞内共定位呈现的黄色荧光消失，绿色和红色荧光在胞内散在分布，提示LPS-TLR4共定位消失。②CQ预处理抑制RAW264.7细胞内体酸化成熟，6FAM-CpG DNA刺激30min后，激光共聚焦显微镜观察结果显示6FAM-CpG DNA与Cy5-TLR9在胞内共定位呈现的黄色荧光消失，绿色和红色荧光在胞内散在分布，提示CpG DNA-TLR9共定位消失。③动态观察内体酸化成熟障碍后LPS与TLR4在胞内的共定位情况TLR4::YFP标记质粒转染HEK293细胞未获成功。CQ预处理后激光共聚焦显微镜观察不同时相点LPS-TLR4的胞内分布，结果显示共定位的FITC-LPS与Cy3-TLR4呈现的黄色荧光逐渐减少，40min时已完全看不到黄色荧光，而是绿色和红色荧光在细胞内散在分布。④内体酸化成熟障碍对内体循环相关调控分子的作用CQ预处理抑制内体酸化成熟后再加入LPS刺激，Rab7b的mRNA表达较未加CQ处理前显著下降，而Rab10和Rab11a的mRNA表达较未加CQ处理前显著上调。(2)内体酸化成熟障碍对炎症负调控分子的作用LPS刺激RAW264.7细胞后，负调控分子A20，Tollip，MyD88s的mRNA表达显著上调，而CQ预处理1h后再加入LPS(100ng/ml)刺激，A20，Tollip，MyD88s的mRNA表达较LPS组均有显著上调(P<0.05)。结论(1)内体酸化成熟障碍对LPS-TLR4介导的MyD88依赖和TRIF-TRAM依赖的两条信号转导途径均有抑制作用。(2)内体酸化成熟障碍可导致LPS-TLR4介导的炎症负调控分子的表达上调，这可能与MyD88依赖和TRIF-TRAM依赖的两条信号转导途径被抑制调密切相关。(3)内体酸化成熟障碍可导致内化后的LPS-TLR4复合物在胞内累积，出现散在分布、共定位明显减少甚至消失的现象，其机制可能为：内体的酸化成熟并非内体中受体和配体解离的单一因素，可能存在其它多种因素的综合作用。内体酸化成熟障碍可能会影响内体成熟的整个过程，从而对内体中受体和配体的分离、代谢及循环等正常活动产生影响。内体酸化成熟障碍后，由于Rab7b表达减少，内体与溶酶体融合障碍，可能使解离后的LPS和TLR4降解代谢障碍；同时由于Rab10和Rab11a的表达增加，可能使TLR4在早期内体与高尔基体间以及从循环内体至早期内体的转运增多、回膜障碍，最终导致了LPS和TLR4在胞内的累积，从而出现它们在胞内散在分布、共定位消失的现象。其具体的分子机制值得进一步深入研究。