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研究目的动脉粥样硬化被认为是一种慢性低度炎性状态。包括巨噬细胞在内的多种炎症细胞浸润以及其释放的炎症因子参与了动脉粥样硬化的发生发展,其中巨噬细胞在动脉粥样斑块发展的各个环节中均发挥重要作用。在早期斑块阶段,巨噬细胞通过胞葬作用减轻局部炎症反应及继发性细胞坏死,延缓斑块进展;然而,随着疾病进展,斑块内巨噬细胞凋亡增加,斑块内部形成坏死性内核,斑块去稳定化,形成易损斑块。因此,减少斑块内巨噬细胞浸润和凋亡是抗动脉粥样硬化药物研发的靶点。irisin近年来被发现的肌肉来源的多肽,体内外研究显示irisin对多种代谢紊乱,如肥胖、高血糖、高血脂、非酒精性脂肪肝等具有显著改善作用,并具有抗炎、抗凋亡作用。由于代谢紊乱及炎症是动脉粥样硬化发生的重要危险因素,irisin的潜在抗动脉粥样硬化作用成为研究热点。已有体外研究显示irisin促进内皮细胞增殖、减少内皮细胞凋亡;动物体内研究显示irisin可以缩小动脉硬化斑块面积,降低斑块内炎症细胞浸润,减少炎症细胞因子表达及氧化应激、改善内皮细胞功能不全等作用。尽管巨噬细胞在动脉粥样硬化发生的各个阶段均发挥重要作用,目前少有研究观察irisin对巨噬细胞的影响。Mazur-BialyAI等的体外研究显示,irisin对体外培养的巨噬细胞活力,包括凋亡或坏死无显著影响,但可以促进巨噬细胞的增殖。尽管有研究采用apoE基因敲除糖尿病小鼠观察到irisin干预后斑块面积显著缩小,斑块内巨噬细胞和淋巴细胞的浸润减少,但irisin对斑块内细胞凋亡及斑块稳定性的影响尚无相关研究报道。因此本研究利用体外ox-LDL培养的巨噬细胞和apoE基因敲除的小鼠,在体外观察irisin对巨噬细胞内脂质蓄积、增殖和凋亡的影响,在体内观察irisin对动脉粥样硬化斑块面积以及稳定性的影响,以及irisin对斑块内巨噬细胞浸润、细胞凋亡的影响,并初步探讨内质网应激在irisin抗巨噬细胞凋亡中的作用。研究方法一、体内研究部分1、模型的建立及分组8周龄SPF级雄性apoE-/-小鼠及同周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠分别给予高脂词料及普通饲料。造模成功后随机分为3组:模型组(给以同等剂量生理盐水腹腔注射,n=8只)、干预组(irisin腹腔注射0.5ug/g.d,n=8只)、野生对照组(给以同等剂量生理盐水腹腔注射,n=8只),每天测体重,连续注射14天。2.标本留取及检测处死小鼠后留取外周血、完整的胸腹主动脉全长,转移-80度冰箱保存。对主动脉根部连续切片,厚度调至大约6μm,留取组织切片。血液标本测定血脂。动脉标本采用HE染色观察斑块面积,油红O染色观察斑块内脂质沉积,Masson三色染色观察主动脉中胶原蛋白含量,免疫荧光化学法检测主动脉根部斑块内巨噬细胞标志物MOMA-2表达、平滑肌细胞含量及内质网应激标志物C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达,TUNEL法测定斑块内细胞凋亡,Western Blot法检测CHOP蛋白表达。二、体外研究部分体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予20、40和80ng/ml的irisin预处理30 min,再分别加入100 mg/L ox-LDL和5 mg/L TM继续培养12 h。分别采用MTT法和AnnexinV-FITC双染法检测细胞活力和凋亡情况;油红O染色观察细胞内脂滴含量;免疫荧光细胞化学法检测转录激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)核转位情况;采用Western blot检测p-PERK和p-eIF2a、CHOP和Bcl-2的表达。三、统计分析方法用SPSS17.0统计软件进行所有的统计分析,数据以均值土标准差的方式表示。用Image-Pro Plus软件检测斑块的面积及阳性染色区域面积,并计算出阳性区域占斑块总面积的比例,进行统计分析。实验组与对照组差别用非配对的t检验法分析,以p<0.05为有统计学意义。研究结果一、体内研究部分1.一般情况及体重、血脂的变化动物在试验期间一般情况良好,精神状态佳,活动自如,毛发光泽顺滑,饮食及大小便正常。试验结束后,irisin干预组(31.12±3.29g)和模型组小鼠的体重(28.33±2.20g)显著高于野生组(26.31±2.19g)(P<0.05),但irisin干预组和模型组之间体重无显著差别(P>0.05)。模型组小鼠血脂水平较正常对照组显著升高(P<0.01),但irisin处理组与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。2.irisin治疗减少apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的生成irisin可以减少斑块的生成,模型组动脉全长中阳性率为18.97%,irisin治疗组阳性率为5.61%(P<0.01)。HE染色结果显示irisin显著减少主动脉根部病变总面积(P<0.01),治疗组粥样斑块面积占模型组的70.83%。油红O染色结果也显示irisin显著减少主动脉根部病变总面积(P<0.01),模型组和治疗组的脂质阳性区百分比分别为18.42%和 9.65%。3.irisin增加apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的稳定性Masson三染色法显示主动脉根部斑块内胶原含量,与模型组比较,irisin治疗组主动脉根部斑块内胶原纤维含量明显增加,为模型组的155%(P<0.05)。TNUNEL原位凋亡法检测小鼠主动脉根部粥样斑块内细胞凋亡情况,与模型组比较,irisin干预组主动脉根部斑块细胞凋亡率明显降低,为模型组的61.2%(P<0.01)。免疫荧光染色法检测斑块内巨噬细胞浸润及平滑肌细胞含量,结果显示,irisin干预组主动脉根部病变斑块巨噬细胞标志物MOMA-2染色阳性区(红色荧光区)少于模型组,为模型组的63.28%(P<0.01);而主动脉根部病变平滑肌细胞染色阳性区(绿色荧光区)显著增多,为模型组的 244%(P<0.01)。4.irisin对动脉粥样硬化斑块内CHOP表达的影响免疫荧光法显示,irisin处理组动脉粥样硬化斑块内内质网应激标志蛋白促凋亡蛋白CHOP表达显著减少,为模型组的64.15%(P<0.05)。Western blot检测结果显示:与模型组比较,irisin处理组细胞内CHOP蛋白水平明显较低,为模型组的43.94%(P<0.05)。二、体外研究部分1.irisin以浓度依赖的方式减少巨噬细胞内脂质蓄积,并显著抑制ox-LDL和TM所诱导的细胞凋亡。油红O染色显示,与ox-LDL组比较,irisin(20、40和80ng/ml)预处理组阳性细胞明显减少,其平均IA值分别为ox-LDL组的76.74%、56.50%和42.3%(后两者P<0.01);MTT验证irisin对RAW264.7细胞的细胞毒性作用,结果显示,与ox-LDL组相比,20、40和80 ng/rml irisin预处理组细胞细胞存活率呈剂量依赖性增加(分别为13.0%,26.9%,和44.2%)(P<0.05)。采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况可见,irisin与ox-LDL共作用后,细胞总凋亡率较ox-LDL组呈剂量依赖性减少(P<0.05)。作为阳性对照的TM组结果显示,irisin可以减轻TM所诱导的RAW264.7细胞存活率的下降及凋亡率的增加(P<0.05)。2.与 ox-LDL 和 TM 组比较,irisin 组的 CHOP、p-PERK 和 p-eIF-2a 表达显著降低,ATF6由胞浆向核内转移明显减弱,而Bcl-2表达显著增加。采用特异性抗体进行免疫印迹检测,以β-actin校准后的蛋白相对水平反映CHOP、Bcl-2、p-PERK和p-eIF2a的相对含量。结果显示:给予irisin预处理,可以显著抑制ox-LDL和TM所诱导的CHOP、p-PERK、p-eIF2a上调和Bcl-2下调,且呈浓度依赖性。采用SABC-Cy3免疫荧光细胞化学法显示细胞内ATF6可见,ox-LDL组细胞核内出现强荧光染色,而irisin预处理组细胞核内红色荧光强度较ox-LDL明显减弱。研究结论1.irisin干预后apoE敲除小鼠的动脉粥样硬化斑块体积显著低于模型组,提示irisin具有延缓动脉粥样硬化斑块进展的作用。2.irisin干预后斑块内胶原纤维及平滑肌细胞含量显著增加,提示irisin不仅可以延缓斑块进展,还具有稳定斑块的作用。3.irisin抗动脉粥样硬化的作用部分与其减少斑块内巨噬细胞浸润、抑制细胞凋亡有关。4.irisin可能通过减轻内质网应激发挥抑制斑块内细胞凋亡以及稳定斑块的作用。5.体外研究结果显示,irisin可减轻ox-LDL诱导的巨噬细胞内脂质蓄积及凋亡,该作用可能部分通过抑制PERK/eIF2α/CHOP及ATF6/CHOP内质网应激信号通路实现。