研究背景和目的:B系淋巴细胞白血病是儿童常见的恶性肿瘤,目前化疗仍是对其治疗的主要手段。虽然大部分患儿对初始化疗反应较好,但约有20%左右的患儿由于不能耐受常规化疗非特异性毒副作用,导致化疗失败或白血病复发。最近研究发现:从B淋巴细胞白血病患儿的体内分选出CD34+CD19+CD38+/-的细胞注射入新生的NOD/SCID小鼠体内能长出B系白血病细胞,而CD34+CD19-CD38-CD10-的细胞注射入新生的NOD/SCID小鼠体内则表现为正常的细胞表型。可见CD34+CD19+CD38+/-细胞具有自我更新和无限增殖的能力,其也完全不同于髓系白血病干细胞（AML-LSC）,是一类新的干细胞群——B系LSCs。因此,CD19是B系LSCs及其子代白血病细胞表面的特异性标记,是靶向杀伤B系LSC及其子代白血病细胞的良好靶点。目前以单克隆抗体（单抗）为基础的靶向治疗是白血病治疗最有前途的方法之一。CD20和CD33等单抗已在临床分别广泛应用于B系非霍杰金淋巴瘤（B-NHL）和AML的治疗。免疫脂质体是靶向治疗的分支之一,具有单抗导向和脂质体药物传输的双重特性。将免疫脂质体包封抗肿瘤药物,不但可将大量的药物分子特异地传输到肿瘤细胞,还可显著减少对正常组织的非特异性毒性作用。据报道大量的药物分子甚至可以克服肿瘤耐药。目前,免疫脂质体治疗B系血液肿瘤的研究已取的了令人鼓舞的结果,如CD19靶向的柔红霉素（DXR）和长春新碱（VCR）脂质体等在体外能显著增加对CD19+的白血病细胞的细胞毒作用,在体内能显著延长B系模型小鼠的生存时间,CD19靶向的伊马替尼（imatinib）脂质体能将大量的伊马替尼分子传输到SUP-15细胞内,克服了低剂量imatinib所导致的imatinib耐药问题。然而目前报道的免疫脂质体不能有效清除LSCs,因为象DXR和VCR等常规化疗药不能作用于静止期的LSCs。去甲斑蝥素（Norcantharidin,NCTD）是干细胞特异性的杀伤药物,其通过抑制干细胞相关的抗凋亡轴——即下调（HLF/SLUG）的活性,诱导AML-LSCs凋亡。但NCTD对正常HSCs的杀伤作用在一定程度上削弱了其对LSCs的治疗优势。ZCH-4-2E8（简称2E8）是本实验室自行研制的抗人CD19单抗的新克隆,在先前的研究中,我们已证实2E8—NCTD免疫毒素对CD19+的白血病细胞具有明显的靶向杀伤作用。本研究拟采用免疫脂质体技术,将NCTD包封于脂质体中,并与2E8单抗连接,研制成2E8-NCTD-liposomes,观察该免疫脂质体靶向识别并杀伤B系LSCs及其子代白血病细胞的作用,阐明其靶向杀伤的机制,为其进行体内试验奠定基础。方法:（1） 2E8单克隆抗体的制备:采用凝胶过滤层析法从腹水中纯化2E8单抗;流式细胞术检测其对CD19高表达的Nalm-6细胞的靶向效率;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定抗体纯度及分子量。（2） 2E8单克隆抗体修饰的空白脂质体（blank-liposomes）的制备及评价:采用分光光度计建立Stewart分析法的标准曲线（检测脂质体中磷脂的含量）。采用后插技术将2E8与blank-liposomes连接,制备2E8-blank-liposomes;并用流式细胞术证明两者是否连接成功（为做流式检测,Rhodamine标记的磷脂酰乙醇胺——PE,加入脂质体的磷脂中）;结合Stewart分析法和BCA蛋白浓度检测法考察2E8和Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE摩尔比对脂质体表面抗体密度的影响;SDS-PAGIE验证2E8是否以完整的形式插入脂质体表面;激光粒度测定仪检测其粒径并观察其在不同溶液中放置不同时间是否稳定。流式细胞术评价2E8-blank-liposomes和blank-liposomes对不同细胞株（Nalm-6,Raji,Molt-3,K562）和健康者外周血中T、B淋巴细胞的靶向效率以及靶向结合的稳定性;流式细胞术检测游离2E8阻滞2E8-blank-liposomes对CD19抗原的特异性结合能力;激光共聚焦显微镜和流式细胞术（木瓜酶法）观察2E8-blank-liposomes在Nalm-6细胞中的内化作用。（3） 2E8单抗修饰的去甲斑蝥素脂质体（NCTD-liposomes）的制备及评价首先建立脂质体包封率检测的高效液相色谱法（HPLC）。采用薄膜分散法制备NCTD-liposomes,并通过后插技术将2E8与NCTD-liposomes连接,制备2E8-NCTD-liposomes。HPLC测定脂质体的包封率;激光粒度测定仪检测其粒径;流式细胞术和激光共聚焦显微镜评价2E8-NCTD-liposomes和NCTD-liposomes对不同细胞株（Nalm-6,Raji,Molt-3,K562）的靶向效率和差异;流式细胞术检测B淋巴细胞白血病病人骨髓及Nalm-6细胞株中B系LSC（CD34+CD19+CD38+/-）的靶向效率;MTT法评价2E8-NCTD-liposomes,NCTD-liposomes和游离的NCTD对不同细胞株（Nalm-6,Molt-3）的细胞毒作用,并计算各自IC50值。（4） 2E8-NCTD-liposomes的靶向杀伤机制采用激光共聚焦显微镜和HPLC观察2E8-NCTD-liposomes通过CD19受体介导的内化作用将NCTD转运至细胞内的现象。HE染色和琼脂糖凝胶电泳观察2E8-NCTD-liposomes处理后Nalm-6细胞发生凋亡改变（凋亡小体和DNA ladder）;流式细胞术（Annexin V-FITC和PI双标法）检测2E8-NCTD-liposomes处理后Nalm-6细胞的早期凋亡,并定量检测相同浓度的2E8-NCTD-liposomes,NCTD-liposomes和游离的NCTD对Nalm-6和Molt-3凋亡的影响以及不同浓度的2E8-NCTD-liposomes对Nalm-6细胞凋亡的影响。实时荧光定量PCR的方法检测2E8-NCTD-liposomes处理后Nalm-6细胞中与B系LSCs相关的抗凋亡因子HLF和其下游的促凋亡因子NFIL 3在转录水平的相对表达规律。结果:（1）2E8单克隆抗体的制备及鉴定:从Balb/C小鼠腹水中纯化获得高纯度2E8抗体蛋白,经流式细胞术检测,2E8对Nalm-6细胞的靶向识别效率为99.93%,接近于标准进口单抗（阳性对照）CD19 PE对Nalm-6细胞的靶向识别效率（99.94%）。SDS-PAGE鉴定2E8的重链和轻链的分子量分别约为70 kDa和23kDa。（2） 2E8单抗修饰的空白脂质体（blank-liposomes）的制备及评价:随着2E8/Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE的摩尔比增加,平均每个脂质体表面抗体的密度逐渐增加,但抗体与脂质体的连接效率逐渐下降。当2E8/Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE的摩尔比为1:50,Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE与2E8的连接位点达到饱和。流式细胞术结果显示:当2E8-blank-liposomes与Nalm-6细胞孵育后,在右上象限可观察到Rhodamine标记的脂质体的红色荧光（直标法）与GAM-FITC标记2E8的绿色荧光（间标法）成一一对应的直线关系,而在T淋巴细胞白血病细胞株Molt-3细胞中未观察到相似的结果,提示2E8与脂质体连接成功。粒径测定仪检测发现:2E8-blank-liposomes和非靶向的blank-liposomes平均粒径分别为121.25±4.32纳米（nm）和106.32±3.21纳米（nm）;并将其分别放置于HBS缓冲液,含3%吐温80的HBS缓冲液（v/v）中和含50%小牛血清的HBS缓冲液（v/v）中,4℃,至24天,其粒径无显著变化。SDS-PAGE证实2E8-blank-liposomes在制备过程中每一步2E8单抗均以完整抗体的形式插入脂质体表面。2E8-blank-liposomes对Nalm-6和Raji细胞靶向效率（直标法和间标法）几乎接近于100%,显著高于其对Molt-3和急性红白血病细胞株K562细胞的靶向效率（P＜0.01）,也显著高于空白非靶向脂质体（blank-liposomes）对Nalm-6和Raji细胞的靶向识别效率（P＜0.01）;且随着孵育时间的延长和孵育介质的改变（PBS,50%小牛血清,50%人血浆）,2E8-blank-liposomes与Nalm-6细胞的结合稳定,平均荧光强度无显著变化。游离的2E8能阻滞2E8-blank-liposomes与Nalm-6细胞的特异性结合。2E8-blank-liposomes对外周血中正常B淋巴细胞的靶向效率达（97.65±1.30）%,显著高于对正常T细胞的靶向效率（（4.70±1.78）%,P＜0.01）。激光共聚焦显微镜和流式细胞术观察到2E8-blank-liposomes在30分钟至8小时内被内化入Nalm-6细胞。（3） 2E8-NCTD-liposomes的制备及评价:采用HPLC测定脂质体的包封率为46.51%,粒径测定仪发现2E8-NCTD-liposomes和NCTD-liposomes的平均粒径分别是118.32nm和104.12nm;与2E8-blank-liposomes相似,2E8-NCTD-liposomes对Nalm-6和Raji细胞的靶向识别效率（直标法和间标法）显著高于其对Molt-3和K562细胞的靶向识别效率（P＜0.01）,也显著高于非靶向blank-liposomes对Nalm-6和Raji细胞靶向效率（P＜0.01）;2ES-NCTD-liposomes对B淋巴细胞白血病患者骨髓中CD34+CD19+CD38+和CD34+CD19+CD38-细胞的靶向效率分别为98.00%和92.45%（间标法）,NCTD-liposomes对CD34+CD19+CD38+和CD34+CD19+CD38-细胞的靶向效率不到5%,两者差异具有显著性（P＜0.01）;激光共聚焦显微镜观察发现在Nalm-6细胞表面同时存在Rhodamine的红色和GAM-FITC的绿色荧光信号,而在Molt-3细胞表面则未观察到相似的结果。MTT法检查显示在24-72小时和10-50μM浓度范围内,2E8-NCTD-liposomes对Nalm-6细胞的杀伤呈时间和剂量的依赖关系。相同浓度的NCTD处理细胞24-72小时后,2E8-NCTD-liposomes对Nalm-6细胞的抑制率高于NCTD-liposomes和游离NCTD对Nalm-6细胞的抑制率;也显著高于2E8-NCTD-liposomes对Molt-3细胞的抑制率（P＜0.01）;2E8-NCTD-liposomes对Nalm-6细胞的IC50值低于NCTD-liposomes和游离NCTD对Nalm-6细胞的IC50值;也显著低于2E8-NCTD-liposomes对Molt-3细胞的IC50值（P＜0.01）。（4）2E8-NCTD-liposomes的靶向杀伤机制:激光共聚焦显微镜和HPLC的结果证实:2E8-NCTD-liposomes通过CD19受体介导内化入Nalm-6细胞中。前者观察到Nalm-6细胞在胞浆内出现逐渐累积的红色荧光（Rhodamine）;后者显示:在Nalm-6细胞中2E8-NCTD-liposomes对NCTD的转运效率是在Molt-3细胞中的4倍多;也是NCTD-liposomes对NCTD的转运效率的2倍多。IC50浓度的2E8-NCTD-liposomes处理后的Nalm-6细胞,HE染色的结果显示其出现细胞皱缩,核固缩破碎,凋亡小体形成等典型的凋亡改变;琼脂糖凝胶电泳显示其出现典型的晚期凋亡的DNA ladder条带。流式细胞术的结果也显示:2E8-NCTD-liposomes诱导Nalm-6细胞凋亡呈剂量依赖关系,在相同浓度（IC50浓度/2E8-NCTD-liposomes）下处理细胞72小时,2E8-NCTD-liposomes对Nalm-6细胞的凋亡比例（（47.55±0.02）%）显著高于其对Molt-3细胞的凋亡比例（（8.65±0.01）%,P＜0.01）;也高于NCTD-liposomes（（27.09±0.01）%）或游离的NCTD（（24.22±0.02）%）对Nalm-6细胞的凋亡比例（P＜0.05）。实时荧光定量PCR的结果显示:IC50浓度的2E8-NCTD-liposomes处理Nalm-6细胞48小时后HLF基因相对表达（0.62±0.09）较未处理前（1）降低（P＜0.01）,NFIL3基因相对表达（1.47±0.02）较未处理前（1）增加（P＜0.01）。结论:1、成功研制CD19抗体修饰的免疫脂质体2E8-blank-liposomes和2E8-NCTD-liposomes;2、2E8-blank-liposomes可作为靶向B系LSC（CD34CD19+CD38+/-）及其子代白血病细胞（CD19+）有用的药物载体;3、2E8-NCTD-liposomes可对B系白血病细胞产生靶向细胞杀伤作用;4、2E8-NCTD-liposomes靶向杀伤B系白血病细胞的作用机制是通过CD19受体介导而发生内化,NCTD被转运至细胞内释放,诱导靶细胞凋亡;5、2E8-NCTD-liposomes诱导B系LSC凋亡与抑制LSC相关的抗凋亡轴——HLF/SLUG轴的活性密切相关,即在转录水平与下调LSC相关的抗凋亡因子HLF的表达和上调HLF下游的促凋亡因子NFIL3的表达密切相关。