论文部分内容阅读
研究背景:臂丛神经损伤（brachial plexus injuries,BPIs）,尤其是臂丛神经缺损治疗困难,预后较差,是医学界亟待解决的难题之一。目前,臂丛神经缺损的治疗方法包括自体神经移植、神经移位、肌腱转位、功能性游离肌肉移植等。其中,自体神经移植仍被公认为是治疗周围神经缺损的金标准。然而,自体神经移植面临着供体区域失神经支配、手术并发症较多、直径和神经束不匹配等诸多限制。随着组织工程的发展,组织工程神经移植物（tissue engineered nerve graft,TENG）成为了替代自体神经移植物的良好选择。然而,TENG的研究和应用主要集中于下肢神经,有关上肢神经的研究较少,尤其缺乏针对臂丛神经缺损的研究。在本研究中,我们构建了一种新型的TENG,应用并验证其在大鼠臂丛神经缺损模型中的疗效,从而为TENG在治疗臂丛神经缺损方面的临床转化提供新的思路和实验依据。目的:构建一种新型的细胞外基质化组织工程神经移植物,并将其应用于桥接8mm的大鼠臂丛神经上干缺损,探究新型TENG修复大鼠臂丛神经缺损的疗效。方法:1.将皮肤前体细胞来源的雪旺细胞（skin-derived precursor Schwann cells,SKP-SCs）与壳聚糖神经导管/蚕丝纤维共培养,并进行脱细胞处理。将10束附着有细胞外基质的蚕丝纤维（每束由5根家蚕丝组成）平行排列于附着有细胞外基质的壳聚糖神经导管中,获得新型细胞外基质化的TENG。2.通过细胞免疫荧光染色及扫描电镜分析等方法对新型TENG进行鉴定。3.构建臂丛神经缺损模型,并将新型TENG应用于桥接8 mm的大鼠臂丛神经缺损。同时建立（无细胞外基质包被的）空导管组、（未进行神经修复的神经）缺损组以及自体神经移植组作为对照。4.术后2周,分别取空导管组、自体神经移植组及TENG组中的神经移植物进行免疫组织荧光染色,探究再生神经的生长距离及再生神经面积。5.术后每2周,对各组大鼠进行Terzis梳理实验、足底缺陷实验及疲劳转棒实验等行为学测试,分析比较各组大鼠术后功能恢复情况。6.术后8周,通过神经电生理分析再生神经近端的复合肌肉动作电位（compound muscle action potential,CMAP）及运动神经传导速度（nerve conduction velocity,NCV）,评估各组再生神经的功能。7.术后7周,于各组大鼠患侧肱二头肌内多点注射偶联有异硫氰酸荧光素的霍乱毒素B亚单位（fluorescein isothiocyanate-conjugated cholera toxin subunit B,FITC-CTB）进行逆行示踪,并于1周后对各组大鼠脊髓C5C6节段及损伤侧相应节段的背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）进行免疫荧光染色,分析再生神经是否形成了完整的神经传导通路。8.术后8周,对神经修复吻合口远端的再生神经进行免疫组织荧光染色及透射电镜扫描,分析远端再生神经的轴突数量及髓鞘化程度。9.术后8周,测量各组大鼠的靶肌肉湿重比并对患侧肱二头肌进行免疫组织荧光染色,分析神经肌肉接头（neuromuscular junctions,NMJs）的完全神经再支配情况以及乙酰胆碱受体（acetylcholine receptors,ACh Rs）碎片化数目。结果:1.大量细胞外基质沉积于壳聚糖导管内壁及蚕丝纤维束表面,提示组织工程神经构建成功。2.术后2周,TENG组较空导管组神经再生距离更长、NF-200（+）神经纤维面积更大;而与自体神经移植组相比无明显差异。3.术后2周,各组大鼠的运动功能无明显差异,提示手术成功。术后8周,TENG组的各项行为学结果均优于空导管组,且与自体神经移植组无明显差异。4.TENG组与自体神经移植组再生神经近端CMAP波幅明显高于空导管组,且运动NCV明显快于空导管组。5.TENG组损伤侧相应节段DRG中FITC-CTB标记的感觉神经元比例、脊髓前角内FITC-CTB标记的运动神经元比例均较空导管组显著提升,而与自体神经移植组无明显差异,提示TENG组再生神经已到达目标肌肉。6.TENG组远端再生神经数量、再生神经髓鞘化比例明显优于空导管组（免疫组织荧光染色）,再生有髓轴突直径、髓鞘层数及髓鞘厚度等指标均明显优于空导管组（透射电镜分析）,且与自体神经移植组无显著差异,提示自体神经移植物与TENG均能够有效促进轴突再生及其髓鞘形成。7.TENG组的靶肌肉湿重比明显高于空导管组,且与自体神经移植组无显著差异。TENG组中NMJs完全神经再支配比例较空导管组显著提升（肱二头肌肌纤维免疫荧光染色）,且ACh Rs碎片数量较低;而与自体神经移植组相比无显著差异。结论:1.通过改变壳聚糖导管内部蚕丝纤维束的组装方式,成功构建了富含细胞外基质的新型组织工程神经移植物。2.成功建立了大鼠臂丛神经上干缺损模型,并将新型组织工程神经移植物应用于大鼠臂丛神经缺损的修复。3.该新型组织工程神经移植物可有效修复大鼠臂丛神经缺损,并表现出与自体神经移植物相似的神经修复疗效。