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乙醛酸（Glyoxylate）是光呼吸乙醇酸代谢的中间产物,在体内积累会对植物造成毒害作用。植物体内乙醛酸主要通过光呼吸代谢解毒,但部分乙醛酸可以在乙醛酸还原酶（Glyoxylate reductase,GR）的催化下重新被还原为乙醇酸。已知GR存在2个同工酶,一个定位于细胞质,另一个定位于叶绿体。本论文采用基因敲除和过表达技术,结合酶蛋白的异源表达,探讨水稻（Oryza sativa L.）中GR同工酶的生物学功能。获得的主要实验结果如下:1.OsGR1和OsGR2基因在水稻中的时空差异表达分析根据OsGR1和OsGR2的基因组序列设计定量PCR引物,对其进行时空表达模式分析。结果显示,OsGR2的表达量只有内参基因Actin表达量的6%;OsGR1表达量远高于OsGR2,是OsGR2的15倍;二者的表达均集中在叶、茎与颍壳,但OsGR1在根中也有较高的表达量。在一天的不同时间点及不同生长发育时期测定酶活,发现水稻GR还原NADPH的活力一般是还原NADH的2倍左右。2.OsGR1和OsGR2基因敲除与过表达转基因植株的获得构建了pYLCRISPR/Cas9-OsGR1、pYLCRISPR/Cas9-OsGR2基因敲除载体及组成型pOE-OsGR1过表达载体。通过农杆菌介导法将其转入水稻愈伤组织,成功获得了多个阳性转基因植株。进一步的分子检测、Western blot与活性测定表明,在DNA水平上,突变体gr1的OsGR1基因和突变体gr2的OsGR2基因均成功突变;相对于野生型,突变体gr1与gr2株系在mRNA水平表达量均下调8090%;Western blot检测显示gr突变体基本无相应蛋白表达;gr1株系酶活下调3040%,而gr2株系酶活只下调约10%左右;GR1OE与GR2OE的T3代植株在mRNA、蛋白表达及酶活水平上均有显著上调。3.OsGR与水稻草酸积累的关系单突变体gr与GROE株系与野生型相比均无明显表型差异。选取不同的种植方式与不同叶位取样测定草酸含量,结果显示,与野生型植株相比,突变体gr株系的草酸含量高出2633%,而GR2OE 4-6与GR1OE168-2-2-5株系的草酸含量下降了20%左右,但过表达株系GR2OE12-2-4与GR1OE187-2-1-3的草酸含量与WT基本相同。4.OsGR1和OsGR2的异源表达与酶学特性分析构建了pET30a-OsGR1和pET28a-OsGR2异源表达载体,然后在大肠杆菌中诱导表达。OsGR1和OsGR2在大肠杆菌中均能表达出具有催化活性的可溶性酶蛋白,利用Ni柱亲和层析分离纯化并获得高纯度可溶性蛋白。采用控制底物浓度相对变化的方法测定OsGR1和OsGR2的酶学参数,动力学分析显示,以NADPH为辅酶时,OsGR1和OsGR2催化乙醛酸的Km分别是0.03和0.072mM,以乙醛酸为底物时,其催化NADPH的Km值分别是0.267 mM和0.144 mM,分别是NADH的Km的1.5倍与3倍（0.42 mM,0.403 mM）;OsGR1对乙醛酸的亲和力高于OsGR2,但催化乙醛酸还原的Vm只有OsGR2的1/3左右（68 U/mg protein,262U/mg protein,以NADPH为辅酶时）。当以NADPH为辅酶还原乙醛酸时,草酸对其抑制作用很小,而以NADH为辅酶时,草酸的Ki分别是3 mM与8 m M,意味着生理条件的草酸会对酶产生抑制作用。综上所述,OsGR1与OsGR2可能在消除乙醛酸毒性及光呼吸代谢调控中起作用。此外,本研究进一步证实乙醛酸是水稻中草酸合成的有效前体,因此GR同工酶也可能在调控草酸代谢中发挥作用。