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本课题组前期研究发现喜树碱(Camptothecin,CPT)处理甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠细胞系IOZCAS-SPEX-Ⅱ后,细胞内活性氧(ROS)大量积累,造成细胞内蛋白质、脂质和DNA损伤,钙离子内流,线粒体膜电位下降,诱导细胞发生凋亡,随后转录组测序发现甜菜夜蛾谷氧还蛋白1(Glutaredoxin1,Grx1)基因表达量在这一过程中发生改变。因此,推测甜菜夜蛾Grx1可能参与了喜树碱处理所造成的细胞氧化胁迫损伤、细胞凋亡过程中多种蛋白质的修饰与信号传导,从而对氧化应激、凋亡过程进行了调节。然而,Grx1基础生物学特性及抗氧化机制并没有得到系统、深入的研究。因此,本论文采用了RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆、原核表达与纯化、RNA干扰(RNAi)、转录组测序、实时荧光定量PCR以及转录组测度等实验方法,以CPT作为甜菜夜蛾细胞氧化胁迫和细胞凋亡的诱导剂,解析甜菜夜蛾谷氧还蛋白1(SeGrx1)基因结构;测定SeGrx1氧化还原活性;分析SeGrx1在昆虫氧化胁迫和细胞凋亡过程中的调控功能及机制;挖掘SeGrx1的互作因子;从而探索新的杀虫剂作用靶标和生态安全性害虫防治策略。主要取得了以下几方面的结果:(1)SeGrx1基因基本生物学特征。甜菜夜蛾SeGrx-1基因cDNA全长738 bp(GenBank登录号:MK318813),开放阅读框(ORF)全长351 bp,编码116个氨基酸,预测蛋白的相对分子量为12.57 kDa。通过生物信息学分析,发现SeGrx1蛋白含有经典的KXXCPYC催化位点,属于双巯基谷氧还蛋白,同时催化位点和GSH结合口袋氨基酸的保守性也表明SeGrx1具有典型的谷氧还蛋白酶活性功能。SeGrx1对底物谷胱甘肽还原酶具有氧化还原活性,在保护昆虫组织免受氧化胁迫损伤中发挥重要作用。通过原核表达获得了SeGrx1纯化蛋白,并分析测定了其酶催化反应动力学常数。构建SeGrx1的原核蛋白表达载体,通过不断优化诱导和纯化条件,甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx-1成功在体外大量表达,获得纯度在95%以上的SeGrx1目的蛋白。获得SeGrx-1比活力为0.577 U/mg prot,最大反应速度Vmax为20.5 U/mg pro,米氏常数Km为14.3 nM。发现酶活性和催化活性都比较高,为进一步挖掘谷氧还蛋白的生物学功能,掌握其在昆虫氧化胁迫及凋亡等生命活动中的作用提供理论基础。(2)SeGrx1对喜树碱氧化胁迫和细胞凋亡的调控作用。采用RNAi技术对SeGrx1基因进行表达沉默,发现SeGrx1基因对CPT的氧化胁迫高度敏感,细胞通过维持ROS在合适水平,来保护细胞免受氧化应激和抵御CPT诱导的细胞凋亡,从而维持抗氧化系统的平衡,与含有硫醇的分子如Trx(Thioredoxin,Trx)和Prx(Peroxiredoxin,Prx)构成了线粒体硫醇调节装置,调节线粒体重要酶的功能,以响应线粒体氧化还原状态的变化。(3)甜菜夜蛾SeGrx1相互作用因子挖掘。转录组测序对处理后的细胞进行测序和生物信息学分析,发现6353个基因表达上调,7296个基因表达下调,与正常细胞用CPT处理相比,共有5210个特有差异基因。从5210个差异基因中挑选了26个进行实时荧光定量PCR验证,发现CPY4c1、Uqcrc2、Txn2、Prdx5、Timm22、AGAP0199、chchd4和GstD1这8个基因差异显著,它们都是一些与线粒体氧化还原相关的基因,为绘制昆虫氧化胁迫和细胞凋亡信号传途径提供基础。同时在特有差异基因库中发现了BNIP3和ASK1。克隆了SeBNIP3基因的cDNA全长(GenBank登录号:MK318815),开放阅读框582bp,编码193个氨基酸,SeBNIP3含有一个BH3结构域对细胞凋亡有促进作用;克隆了凋亡诱导激酶SeASK1基因的cDNA全长(GenBank登录号:MK318816),开放阅读框4176 bp,编码1391个氨基酸;同时克隆了与SeGrx1同家族基因SeGrx3的cDNA全长(GenBank登录号:MK318814),开放阅读框(ORF)663 bp,编码220个氨基酸,预测SeGrx3可能参与细胞铁代谢,和SeGrx1一样调节细胞的氧化胁迫反应。结合转录组数据和功能预测分析,SeGrx3、SeBNIP3和SeASK1参与昆虫氧化胁迫、凋亡调控,可能与SeGrx1存在互作。(4)SeGrx1对CPT杀虫效果的影响。比较了SeGrx1dsRNA联合植物次生代谢物CPT使用与单独使用CPT和dsRNA对甜菜夜蛾的抑制效果,结果表明dsRNA和CPT联合使用有更显著的抑制效果。本研究的结果为RNAi技术与CPT联合使用在鳞翅目昆虫防治领域提供了创新的策略。综上所述,甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx-1成功在体外大量表达,并且获得了它的酶-动力学参数,为进一步挖掘谷氧还蛋白的生物学功能,探索其在害虫防治中的应用提供基础。甜菜夜蛾SeGrx1通过构建线粒体硫醇信号调节装置,在维持抗氧化系统平衡、保护细胞免受氧化应激和抗CPT诱导的凋亡等方面发挥重要作用,为RNAi技术结合CPT防治鳞翅目昆虫提供了一种创新策略。