类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei)简称类鼻疽菌,是一种革兰氏阴性的条件致病菌,引起的疾病称为类鼻疽。类鼻疽作为一种热带医学病,广泛流行于东南亚和澳大利亚北部地区,以及我国的香港、海南、台湾等地。类鼻疽的临床表现形式多样,包括局部器官脓肿肺炎、急性败血症等,全球每年约8.9万人死亡,死亡率高达40%。由于B.pseudomallei潜在的生物威胁,美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)将其列为Ⅰ类生物战剂。B.pseudomallei存在于土壤和水中,具有广泛的抗生素耐药性,目前尚无有效的疫苗,亟需寻找新的治疗类鼻疽的临床策略。病原菌和宿主的相互作用是决定其感染和发病的前提,深入揭示B.pseudomallei的致病机制将为其防治提供新的靶点和理论指导。课题组长期致力于B.pseudomallei的感染免疫机制研究,前期实验中观察到B.pseudomallei感染能诱导内质网应激并导致细胞凋亡的现象,其生物学意义和分子机制自然引起我们的兴趣和关注,并成为本论文研究的课题。研究表明,福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌等细菌能促进巨噬细胞凋亡,保护细菌不被吞噬,促进细菌存活,提示抑制巨噬细胞凋亡可能有利于胞内细菌清除。已有研究报道B.pseudomallei可诱导小鼠巨噬细胞凋亡基因的表达,而前期我们发现B.pseudomallei感染能诱导内质网应激并导致细胞凋亡,是否可以通过抑制内质网应激诱导的凋亡促进感染的B.pseudomallei的清除?牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)是由牛磺酸与熊去氧胆酸(UDCA)在肝脏内结合生成的结合性胆汁酸,研究发现其具有内质网应激抑制剂的功能。TUDCA可以通过提高细胞处理胞内未折叠蛋白的能力,减少细胞凋亡,从而对细胞起到保护作用。在临床上,TUDCA已作为治疗肝胆性疾病的药物,并对其他疾病有改善作用,包括甲型流感、慢性丙型肝炎、骨关节炎、肾病和糖尿病等。为此,本研究拟通过B.pseudomallei感染C57BJ/6小鼠模型和RAW264.7细胞模型分别在体内外观察TUDCA对B.pseudomallei的清除作用,并采用透射电镜、激光共聚焦、RT-q PCR、流式细胞术、western blot和si RNA干扰等方法初步揭示TUDCA通过抑制内质网应激诱导的凋亡促进B.pseudomallei清除的作用机制。首先,我们建立了B.pseudomallei感染C57BJ/6小鼠和RAW264.7细胞模型,分别通过生存率实验、组织病理学分析、累及脏器细菌载量检测等体内实验和细菌胞内存活体外实验观察了TUDCA对B.pseudomallei的清除作用,发现TUDCA提高了类鼻疽小鼠的存活率,减轻了类鼻疽小鼠的肺、脾、肝的炎症反应,降低了肺、脾、肝的细菌载量,抑制了B.pseudomallei在RAW264.7细胞内的生存能力,结果表明TUDCA具有促进清除B.pseudomallei的作用。接着我们在RAW264.7细胞感染模型分析了B.pseudomallei通过诱导内质网应激导致细胞凋亡的分子过程:利用流式细胞术和western blot检测了B.pseudomallei感染后RAW264.7细胞的凋亡情况,发现细胞的凋亡数量随着B.pseudomallei感染时间的延长而增加,且caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白表达增加,证实了B.pseudomallei能诱导RAW264.7细胞的凋亡。同时,通过透射电镜和激光共聚焦观察B.pseudomallei感染后RAW264.7细胞的内质网形态结构的变化,发现B.pseudomallei感染导致内质网明显的肿胀,且内质网的结构蛋白钙网蛋白的分布由紧密变为弥散状态。进一步,通过western blot和RT-q PCR实验,发现随着B.pseudomallei感染RAW264.7细胞的时间延长,内质网应激相关蛋白Bip/CHOP/PERK/XBP1 m RNA和蛋白水平的表达增加、ATF6则表达降低,B.pseudomallei感染导致内质网应激增强。由于内质网应激的持续存在会导致细胞的凋亡,我们继续探究了B.pseudomallei诱导的内质网应激和细胞凋亡的关系。Western blot结果显示caspase-12的蛋白表达随着B.pseudomallei感染时间的延长而增加。以si RNA干扰内质网应激信号分子CHOP,流式细胞术和western blot检测发现抑制内质网诱导的凋亡途径后,细胞凋亡数量明显减少,且caspase-3、cleaved caspase-3和caspase-12的蛋白表达降低,进一步说明内质网应激参与了B.pseudomallei诱导的细胞凋亡。最后,在RAW264.7细胞感染模型我们初步揭示了TUDCA通过抑制内质网应激诱导的凋亡促进B.pseudomallei清除的分子机制:RAW264.7细胞进行TUDCA预处理后,再检测细胞凋亡和内质网应激的情况。通过流式细胞术发现,TUDCA处理后的B.pseudomallei诱导RAW264.7细胞的凋亡数量明显减少;透射电镜和激光共聚焦实验发现TUDCA处理后的内质网肿胀程度减弱,钙网蛋白的弥散程度也减轻;同时western blot和RT-q PCR结果也显示,TUDCA处理组的Bip、CHOP、PERK、XBP1的m RNA和蛋白水平表达降低,ATF6的表达升高。这说明TUDCA抑制了B.pseudomallei诱导的内质网应激。且TUDCA处理后,B.pseudomallei诱导的caspase-3、cleaved caspase-3和caspase-12的蛋白表达明显降低,证实了TUDCA通过抑制内质网应激降低B.pseudomallei诱导的细胞凋亡。另外,沉默CHOP后,胞内存活实验发现,TUDCA处理组和PBS对照组的B.pseudomallei在RAW264.7细胞内的存活数量无明显差异,进一步说明,TUDCA通过抑制内质网应激诱导的凋亡促进B.pseudomallei的清除。综上所述,本课题从内质网应激的角度探讨了TUDCA在治疗B.pseudomallei感染中的作用及机制,初步阐释了TUDCA可能通过抑制内质网应激减少B.pseudomallei诱导的细胞凋亡,进而促进B.pseudomallei在宿主细胞中的清除机理。该研究一方面揭示了B.pseudomallei感染、内质网应激和凋亡的关系,另一方面为寻找治疗类鼻疽的方法提供了新思路。