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目的:
获得性免疫缺陷综合症(Acquired immune deficiency syndrome， AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种严重传染病。HIV感染后，人体免疫系统针对病毒产生细胞毒等多种抗病毒免疫应答，抑制病毒复制并杀伤清除病毒，同时免疫系统的负调节机制也反馈性发挥作用，避免过强的免疫应答导致免疫损伤。在HIV等慢性病毒感染中负调节机制则促进了效应细胞的衰竭凋亡，导致T细胞稳态的变化及功能耗竭。PD-1(CD279，encoded by Pdcd1)、Tim-3(T cellimmunoglobulin-3)是分属于CD28/B7和Ig超家族的两个重要的负性调控分子，两者分别与Galectin-9和PDL结合并传递抑制性的第二信号，进而抑制T细胞分泌细胞因子，影响T细胞移植免疫耐受能力，并抑制T淋巴细胞的抗病毒应答，诱导其凋亡，降低其杀伤病毒的作用，最终诱导STAT3/P38MAPK通路活化，影响免疫平衡和疾病进展。对HIV感染的研究显示，Tim-3、PD-1定义了不同的T淋巴细胞亚群，但其表达模式与疾病进展的关系研究并不一致。共用γ链细胞因子(γ-c)的IL-2、IL-7、IL-15、IL-21在免疫应答、内环境稳态的维持和T细胞的增殖、存活、功能方面扮演重要角色。Tim-3、PD-1的不同表达模式受到γ-c细胞因子的影响不尽相同，γ-c细胞因子诱导的Tim-3、PD-1发挥怎样的抑制作用也不明确。本研究对不同疾病进展的HIV感染者T细胞的Tim-3、PD-1表达模式及其与疾病进展之间的关系进行研究，明确Tim-3、PD-1的不同表达亚群及双重阻断对于HIV感染的T淋巴细胞功能及疾病进展的影响，并研究在γ-c细胞因子作用下T细胞Tim-3、PD-1表达模式的变化及对效应细胞分泌功能的影响，为HIV感染的致病机制及免疫治疗提供重要信息。
方法:
1、研究对象
本研究选取未接受抗病毒治疗、感染时间2年以上的HIV慢性感染者（chronicHIV infection，HIV组）35例，男性34例，女性1例，平均年龄21-59岁，多经性传播途径感染。健康对照（normal control，NC组）9例为随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人，男性5例，女性4例，平均年龄26-40岁。
2、CD4+T细胞绝对值及病毒载量的检测
将20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中，逆向加样法加50μl混匀的抗凝全血，室温避光15min，加入1×免洗溶血素450μl，室温避光15min，应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，MultiSET软件分析结果，得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。病毒载量检测采用Roche公司TheCOBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)HIV-1 Test试剂盒在COBAS(R)TaqMan(R)系统进行全自动PCR反应体系制备。
3、T细胞表面Tim-3、PD-1的检测
提取人外周血单个核细胞(PBMC)，调整细胞浓度约1×106 cells/管，表面染色CD3-APC-cy7、CD8-PerCP、Tim-3-PE、PD-1-FITC，4℃染色30分钟。用含1％FBS的PBS清洗细胞2遍，加入300μ11％多聚甲醛固定，应用FACS LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。
4、T细胞表达Tim-3、PD-1的细胞分泌功能
提取PBMC，调整细胞浓度约0.5×106 cells/孔，加入96孔板，同时加入HIVgag pool（10μg/ml），TCR刺激孔是与包被Anti-CD3/Anti-CD28共培养3天。阻断孔加入Anti-Tim-3/PD-1共培养，收取细胞前5小时加入GlogiStop。培养结束后用含1％FBS的PBS清洗一遍，用抗体CD3-Percp、CD4-APC-cy7进行表面染色。室温破膜15分钟，用1×破膜洗液清洗，胞内染色IFN-γ-PE-cy7/APC、IL-2-APC，4℃孵育30分钟。用1％的多聚甲醛固定。应用FACS LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。
5、γ-c细胞因子诱导Tim-3、PD-1的检测
提取PBMC，调整细胞浓度约0.5×106 cells/孔，加入96孔板，同时加入γ-c细胞因子IL-2、IL-7、IL-15、IL-21。包被Anti-CD3/Anti-CD28共培养5天，培养结束后用含1％FBS的PBS清洗一遍，用抗体CD3-Percp、CD4-APC-cy7、Tim-3-PE、 PD-1-FITC进行表面染色。用1％的多聚甲醛固定。应用FACS LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。
6、γ-c细胞因子诱导Tim-3、PD-1功能的检测
提取PBMC，与γ-c细胞因子(IL-2)和完全1640在温箱内共孵育6天，第三天换液，在第六天收取细胞，用含1％FBS的PBS清洗一遍。调节细胞浓度约0.5×106 cells/孔，加入96孔板，同时用IL-2，gag pool肽段，包被的Anti-CD3/CD28再刺激。阻断孔加入anti-Tim-3/PD-1共培养，收取细胞前5小时加入GlogiStop。培养结束后用含1％FBS的PBS清洗一遍，用抗体CD3-Percp、CD4-APC-cy7进行表面染色。室温破膜15分钟，之后用破膜洗液清洗一遍，胞内染色IFN-γ-PE-cy7/APC、IL-2-APC，4℃，30分钟。用1％的多聚甲醛固定。应用FACSLSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。
7、统计学分析
应用SPSS17.0软件包进行统计分析，实验组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，阻断实验比较采用配对样本t检验，p＜0.05为有统计学意义。流式图采用Flowjo7.2.5分析，统计分析图采用GraphPad Prism5，Canvas12绘制。
结果:
1、HIV慢性感染者T细胞表达Tim-3、PD-1与疾病进展的关系
HIV慢性感染者CD4+Tim-3-PD-1+、CD4+Tim-3+PD-1+、CD4+Tim-3+PD-1-三群的比例明显高于健康对照组(p=0.01、p=0.001、p=0.002);CD8+Tim-3-PD-1+、CD8+Tim-3+PD-1+、CD8+Tim-3+PD-1-三群的比例也显著高于健康对照组(p=0.002、p=0.002、p=0.001)。T细胞表达Tim-3、PD-1的三亚群在CD4+T＜350和VL＞20000组均高于CD4+T＞350和VL＜20000组，除了CD8+Tim-3-PD-1+没有统计学意义外其他均存在显著性差异。CD4+Tim-3-PD-1+、CD4+Tim-3+PD-1+、CD4+Tim-3+PD-1-与CD4+T负相关（p≦0.001），与LgVL正相关(p=0.002、p=0.003、p＜0.001);而CD8+Tim-3-PD-1+、CD8+Tim-3+PD-1+、CD8+Tim-3+PD-1-也与CD4+T负相关(p=0.018、p＜0.001、p＜0.001)， CD8+Tim-3+PD-1+、CD8+Tim-3+PD-1-与LgVL正相关(p＜0.001)。
2、HIV慢性感染者Tim-3、PD-1各亚群分泌功能
除了IFN-γ+CD4+T组别，随着PD-1和Tim-3的表达，Tim-3-PD-1-、Tim-3-PD-1+、Tim-3+PD-1-、Tim-3+PD-1+分泌功能有依次降低的趋势。并且Tim-3+PD-1+与Tim-3-PD-1-，Tim-3-PD-1+两群有统计学意义(p＜0.05)。
3、双重阻断Tim-3、PD-1以后可以部分恢复T细胞的分泌功能
双重阻断Tim-3、PD-1可以部分恢复TCR刺激的CD4+T分泌IL-2、IFN-γ，CD8+T分泌IFN-γ的能力(p＜0.05)，对Gag肽段刺激后T细胞的分泌能力也有恢复的趋势。
4、γ-c细胞因子对于Tim-3、PD-1各群变化的影响γ-c细胞因子及TCR诱导的Tim-3+PD-1+，Tim-3+PD-1-两亚群变化明显高于Tim-3-PD-1+亚群，并且Tim-3+PD-1+亚群的变化也有高于Tim-3+PD-1-的趋势。而γ-c诱导Tim-3+PD-1+，Tim-3+PD-1-两个亚群变化与未刺激比较发现IL-15(p＜0.01)的诱导作用最强，其次为IL-2、IL-7(p＜0.05)。
5、γ-c细胞因子诱导Tim-3+PD-1+细胞亚群对于不同的外源性刺激有不同的抑制功能
IL-2诱导的Tim-3、PD-1对HIV gag肽段和TCR再刺激的T细胞的分泌能力有明显的抑制作用。anti-Tim-3/PD-1阻断后可以恢复gag再刺激后CD4+T分泌的IL-2、IFN-γ和CD8+T分泌的IL-2(p＜0.05)，anti-Tim-3/PD-1阻断后也可以恢复TCR再刺激后CD4+T分泌的IFN-γ和CD8+T分泌的IL-2、IFN-γ(p＜0.05)。而诱导的Tim-3、PD-1对于IL-2再刺激没有明显的抑制作用，阻断Tim-3、PD-1后T细胞的分泌能力未见恢复。
结论:
HIV慢性感染者Tim-3、PD-1表达与疾病进展相关，并且代表功能最耗竭的细胞亚群，阻断Tim-3、PD-1可以恢复T细胞的分泌功能，并且双重阻断有协同放大的作用。γ-c细胞因子可以诱导Tim-3、PD-1表达，尤其是Tim-3+T细胞。诱导来的Tim-3、PD-1对于gag肽段，TCR再刺激有抑制作用。