胃癌的发病率和死亡率在我国均位列恶性肿瘤的第二位,严重危害人民群众的健康和生命。胃癌是一高度异质性的复杂疾病,因此其个体化治疗受限,最终导致胃癌治疗困难、治疗反应各异及靶向药物缺乏。因此,阐明胃癌异质性的分子基础,寻找新的预后标志和治疗靶标,是提高胃癌治疗疗效的关键。癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）计划是近年来肿瘤研究领域的重大突破。尽管TCGA极大地拓展了我们对胃癌分子基础的认识,其分子分型也有利于胃癌的个体化及精准治疗的实施,但是该研究基于多种高通量测序平台,技术手段复杂且代价高昂,临床难以推广。另一方面,人类基因组中大量基因的功能和临床意义仍然有待探索,而对已知功能的基因在持续的研究中也不断有新的发现。上述事实表明,在后分子分型时代,以寻找新的预后标志及治疗靶标为目的,继续探索参与胃癌发生发展的基因并深入剖析其功能机制仍然是十分必要的。CHAF1A基因编码染色质组装因子1的A亚单位p150。CHAF1A不仅参与核小体组装,而且在表观遗传修饰、细胞周期调控、DNA复制、DNA损伤修复等方面发挥广泛而重要的作用,提示CHAF1A可能参与恶性肿瘤的发生发展。近期,研究发现CHAF1A与神经母细胞瘤、结肠癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肝细胞癌及非小细胞肺癌等的恶性表型和预后有关,但其分子机制仍不清楚。CHAF1A与胃癌的关系未见报道。本研究对此展开了系统性研究,内容包括:1)CHAF1A在胃癌中的表达检测和细胞功能实验;2)基于基因芯片和抗体芯片的机制研究;3)CHAF1A的临床意义及其相应的分子基础（基于组织样本的高通量m RNA测序分析）。本研究首次揭示了CHAF1A在胃癌增殖中的作用、机制及临床意义,提供了新的胃癌预后预测分子标志及潜在的治疗靶标,为胃癌个体化及精准治疗提供了新的理论基础,具有重要的科学和临床意义。第一部分CHAF1A在胃癌增殖中的作用第一节CHAF1A在胃癌中的表达目的:通过研究CHAF1A在胃癌细胞系和组织中的表达情况,及CHAF1A与野生型p53和细胞增殖标记MKI67的表达相关性,初步了解CHAF1A在胃癌中的可能作用。方法:q RT-PCR检测CHAF1A在人胃癌细胞系MGC-803、SGC-7901、MKN-45及BGC-823中的表达。利用TCGA数据库和本课题组自建数据库（34例人新鲜胃癌组织及癌旁正常组织的二代高通量m RNA测序数据）,分析CHAF1A m RNA在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达。免疫组织化学检测CHAF1A蛋白在665例石蜡包埋胃癌组织及癌旁正常组织中的表达。免疫组织化学检测野生型p53和MKI67蛋白在胃癌组织中的表达并分析其表达水平与CHAF1A的关系。利用m RNA测序数据,分析CHAF1A与MKI67 m RNA表达水平的关系。结果:1.CHAF1A在胃癌中高表达CHAF1A m RNA在四种人胃癌细胞系中均有表达。在TCGA有配对癌旁正常组织的32例胃癌样本中,CHAF1A m RNA表达升高见于其中30例（93.8%）。在本课题组自建数据库中,与癌旁正常组织相比,CHAF1A m RNA表达升高见于34例胃癌组织中的22例（64.7%）。CHAF1A蛋白高表达见于44.7%（297/665）的胃癌组织,显著高于癌旁正常组织的13.1%（87/665;P<0.001）。2.CHAF1A与野生型p53和细胞增殖标记MKI67的表达有关在野生型p53高表达的胃癌组织中,CHAF1A蛋白高表达率为41.3%,显著低于野生型p53低表达者的50.2%（P=0.026）。在MKI67蛋白高表达的胃癌组织中,CHAF1A高表达率为51.5%,显著高于MKI67低表达者的32.2%（P<0.001）。在TCGA有m RNA表达资料的375例胃癌组织中,CHAF1A与MKI67 m RNA表达水平呈显著正相关（r2=0.344,P<0.001）。在本研究的34例进行了m RNA测序的胃癌组织中,CHAF1A与MKI67 m RNA表达水平同样呈显著正相关（r2=0.298,P<0.001）。结论:CHAF1A在胃癌中较正常组织表达上调,其表达水平与野生型p53呈负相关,与MKI67呈正相关,提示CHAF1A可能促进胃癌的发生。第二节CHAF1A对胃癌增殖的影响目的:通过功能实验研究CHAF1A在胃癌细胞中的作用,揭示CHAF1A对胃癌增殖的影响。方法:建立CHAF1A基因敲减和扩增的胃癌MGC-803和SGC-7901细胞模型。通过Cellomics实时细胞生长实验、MTT细胞活性实验、克隆形成实验及基于流式细胞术的细胞周期和凋亡实验研究CHAF1A在体外（in vitro）的功能。利用m RNA测序数据,分析CHAF1A与细胞周期和凋亡的重要调控基因的表达相关性。建立CHAF1A基因敲减的移植瘤裸鼠模型,研究CHAF1A在体内（in vivo）对肿瘤生长的影响。结果:1.CHAF1A促进胃癌细胞增殖与对照相比,CHAF1A敲减显著减少人胃癌细胞MGC-803和SGC-7901的生长数量和增殖率（P<0.05）,克隆形成实验进一步予以确认。与之相反,CHAF1A扩增显著提高MGC-803和SGC-7901细胞的增殖率（P<0.05）。2.CHAF1A调节胃癌的细胞周期进程及抑制凋亡与对照相比,CHAF1A基因敲减显著增加MGC-803和SGC-7901的S期细胞百分比,而对G2/M期细胞百分比无显著影响,提示S期阻滞的增加（P<0.05）。与对照相比,CHAF1A基因敲减显著增加MGC-803和SGC-7901细胞的凋亡率（P<0.05）。与之相反,CHAF1A基因扩增显著减少S期细胞百分比及减少凋亡率（P<0.05）。3.CHAF1A在胃癌组织中与细胞周期和凋亡的重要调控基因的表达相关在TCGA中,CHAF1A与cyclin A2（编码基因为CCNA2）、Bcl-xl（BCL2L1）及Survivin（BIRC5）的m RNA表达水平呈显著正相关（P<0.05）,而与p21（CDKN1A）的m RNA表达水平呈显著负相关（P<0.05）。在本研究的m RNA测序数据中,CHAF1A与cyclin A2和Survivin的表达也呈正相关（P<0.05）。4.CHAF1A促进胃癌细胞在活体（in vivo）成瘤在活体（in vivo）内,CHAF1A敲减后与未敲减相比显著抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度,并且有更小的肿瘤体积（第24天时分别为254.36±109.20mm3和930.47±262.01mm3;P<0.05）和重量（第24天时分别为0.17±0.06g和0.58±0.15g;P<0.05）。结论:CHAF1A通过调控细胞周期转换并抑制凋亡促进胃癌细胞增殖和成瘤。第二部分CHAF1A影响胃癌增殖的分子机制目的:通过基因表达谱分析和下游信号通路的验证,揭示CHAF1A在胃癌增殖中的作用机制。方法:使用Affymetrix基因芯片研究CHAF1A敲减前后的基因表达谱变化。在生物信息学分析中,信号通路富集分析（pathway enrichment analysis）基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）和Bio Carta数据库。基因本体论（Gene Ontology,GO）分析采用基因集合富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）软件v3.0版。Western blot和m RNA测序数据验证下游信号通路。利用Path Scan抗体芯片检测CHAF1A过表达后的细胞内与压力应激反应及凋亡有关的信号变化。绘制与CHAF1A相关的信号网络图。结果:1.CHAF1A调控原癌/抑癌信号通路及胃癌细胞代谢399个基因的表达水平在CHAF1A敲减前后显著改变。其中,293个基因上调,106个基因下调。生信分析显示,与肿瘤生物学相关的显著改变的信号通路包括:癌症中的转录调节异常（transcriptional misregulation in cancer）、癌症中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、Fox O信号通路、p53信号、细胞因子和细胞因子受体交互作用（cytokine-cytokine receptor interactions）、癌症相关信号通路（pathways in cancer）等。p53信号通路相关基因的Western blot检测显示,THBS1、CDKN1A和IGFBP3的蛋白表达在CHAF1A敲减后显著上调,而在肿瘤组织中,CHAF1A也与这些基因的m RNA表达水平显著负相关（P<0.05）。基于GSEA的GO分析显示,CHAF1A抑制与氧化磷酸化有关的细胞代谢功能,提示糖酵解代谢的增强。2.CHAF1A过表达调控胃癌细胞的压力应激与凋亡信号在MGC-803和SGC-7901细胞中,CHAF1A过表达显著活化HSP27、p38MAPK、NF-κB、Chk1和Survivin,并抑制Bad,在SGC-7901细胞中还额外活化SAPK/JNK（P<0.05）。m RNA测序数据分析显示,CHAF1A与Survivin、NF-κB（NFKB1）及Chk1（CHEK1）的m RNA表达水平显著正相关（P<0.05）。利用基因芯片和抗体芯片的结果,本研究绘制了与CHAF1A相关的信号网络图。结论:CHAF1A通过调控与细胞生长、凋亡、生存、压力应激反应及代谢有关的基因表达最终影响胃癌的增殖。第三部分CHAF1A在胃癌中的临床意义和相应的分子基础目的:通过研究CHAF1A蛋白表达水平与胃癌患者临床病理特征及预后的关系,探讨CHAF1A在胃癌中的临床意义;通过分析m RNA测序数据,研究CHAF1A临床意义之下的分子基础。方法:免疫组化及高通量测序同第一部分;对患者进行生存随访,采用Kaplan–Meier法及Log-rank检验进行生存分析;总生存（overall survival,OS）和无病生存（Disease-free survival,DFS）的影响因素分析采用单因素及多因素Cox比例风险模型,各因素对预后的影响以风险比（hazard ratio,HR）进行描述;GSEA信号通路及GO分析研究CHAF1A临床意义之下的分子基础。结果:1.CHAF1A蛋白表达水平与胃癌患者的特定临床病理特征有关CHAF1A蛋白高表达更常见于非贲门癌,有显著高于贲门癌中高表达率的趋势（48.0 vs 41.1%;P=0.073）。CHAF1A蛋白高表达者的肿瘤神经侵犯率较低表达者显著下降（38.1 vs 51.9%;P<0.001）。CHAF1A蛋白表达水平还与肿瘤大小（P=0.014）和组织学分级（P=0.005）显著相关。2.CHAF1A蛋白表达水平是非贲门胃癌患者的独立预后预测因素在总体研究人群中,CHAF1A蛋白表达水平与OS（P=0.018）和DFS（P=0.048）显著相关。单因素分析显示,CHAF1A蛋白表达水平显著影响OS（P=0.035）,对DFS有显著影响的趋势（P=0.050）。多因素COX回归分析未能发现CHAF1A蛋白表达水平对OS和DFS的独立预测作用（P>0.05）。在亚组分析中,CHAF1A蛋白表达水平与非贲门胃癌患者的OS和DFS均显著相关（P<0.001）,而与贲门癌的OS和DFS均无关（P>0.05）。单因素分析显示,CHAF1A蛋白表达水平显著影响非贲门癌患者的OS和DFS（P<0.001）。多因素COX回归分析显示,CHAF1A蛋白表达水平是非贲门癌患者OS（P=0.015）和DFS（P=0.002）的独立预测因素。CHAF1A蛋白表达水平也与小肿瘤（最大径≤4.5 cm）及神经侵犯阴性患者的OS显著相关（P=0.015和0.005）。3.CHAF1A可能促进瓦博格（Warburg）效应并以患者临床特征依赖性的方式调控胃癌的生物学活动利用34例患者的肿瘤组织m RNA测序数据,与CHAF1A临床意义相关的基因表达谱变化被进一步分析。以CHAF1A m RNA的中位值为分界值,患者被分为CHAF1A高低表达两组。GSEA信号通路分析显示,与细胞周期、DNA复制、DNA修复及代谢等相关的信号通路在CHAF1A高低表达两组间差异最为显著。与基因芯片结果一致,CHAF1A高表达抑制氧化磷酸化。此外,在TCGA中,CHAF1A高表达显著上调所有糖酵解相关酶以及对糖酵解有关键性调控作用的一系列原癌基因如m TOR,MYC和AKT等的m RNA表达（P<0.05）。这些结果表明,CHAF1A抑制氧化磷酸化的同时促进糖酵解,提示CHAF1A促进瓦博格（Warburg）效应。GO分析的结果还提示了CHAF1A的其它功能,如调控基因表达、免疫反应、蛋白功能和定位、细胞衰老和命运、细胞分化和组织发育（包括了多种上皮细胞和神经细胞）。CHAF1A在临床亚组中的生物学功能被进一步分析。与在非贲门癌中相比,CHAF1A在贲门癌中有更强的免疫调节作用,而对细胞增殖有关（包括DNA修复）的作用则减弱;与在神经侵犯阴性胃癌中相比,CHAF1A在神经侵犯阳性胃癌中对神经活动的影响增加,而对细胞增殖相关的影响则减弱;在大和小肿瘤之间,CHAF1A高表达诱导了不同的代谢类型,氧化磷酸化在大肿瘤中上调,而相关通路在小肿瘤中下调。因此,当CHAF1A在肿瘤中以促进糖酵解和细胞增殖为主要且突出的作用时,CHAF1A表达水平则能成为相关患者的预后预测标志。同时,这些结果也提示CHAF1A的作用依赖于临床特征。结论:CHAF1A与胃癌患者的特定临床病理特征有关,是非贲门胃癌患者的独立预后预测因素。CHAF1A可能促进瓦博格（Warburg）效应并以患者临床特征依赖性的方式调控胃癌的生物学活动。