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目的 探究不同分离条件下儿童尿液细胞外囊泡的分离效果及肿瘤细胞增殖标志物Piwil2/Piwil4、肾祖细胞增殖标志物CD133/CD24在肾母细胞瘤、肾积水患者中的表达情况。 方法 ①采用差速离心法与重水-蔗糖垫法分离儿童尿液细胞外囊泡; PBS重悬的17000g沉淀记为C组;140000g沉淀按照不同处理分为以下几组：其中差速离心法包括加入二硫苏糖醇(dithiothreitol;DTT)组(A1组)与未加入DTT组(A2组);重水蔗糖垫法包括PBS重悬单垫组(B1组)与Tris-Hcl重悬单垫组(B2组)。通过透射电镜技术鉴定细胞外囊泡生物学结构;BCA法测定蛋白浓度;蛋白免疫印迹法(Western blot; WB)检测蛋白标志物;纳米微粒跟踪分析技术(Nanoparticle Tracking Analysis;NTA)分析粒径分布。 ②采用免疫荧光、WB及RT-PCR检测肾母细胞瘤患者肿瘤组织、瘤旁肾实质组织Piwil2/Piwil4表达情况以及肾积水患者肾实质组织中与CD133/CD24的表达情况;采用重水蔗糖垫法分离肾母细胞瘤患者、肾积水患者、健康人的尿液细胞外囊泡;WB检测Piwil2、Piwil4与CD133蛋白在尿液细胞外囊泡中的表达。 结果 ①各组均成功分离出尿液细胞外囊泡;在透射电镜下表现为直径为30nm~200nm的双层膜状结构。BCA法蛋白浓度测定显示各组蛋白定量分别为(280.93±84.96)ug、(12.21±3.06)ug、(14.56±2.00)ug、(19.71±3.16)ug、(120.35±4.97)ug。WB结果显示;与17000g沉淀及差速离心法分离的囊泡相比;重水蔗糖垫法分离的尿液细胞外囊泡GAPDH、外泌体标志物CD9、TSG101表达明显增强。纳米微粒跟踪分析技术检测结果显示各组分离的细胞外囊泡中位直径分别为(158.5 ±2.71)nm、(135±17.31)nm、(130±11.27)nm、(134.75±3.86)nm;A1组显著高于其余各组;囊泡浓度分别为(5.27±0.32)×1010/mL、(3.68± 0.07)×1010/mL、(6.72±0.35)×1011/mL、(11.3±0.36)×1011/mL。 ②免疫荧光结果显示肾母细胞瘤肿瘤组织与肾实质组织均表达Piwil2、Piwil4、CD133蛋白;未检测到CD24蛋白表达;RT-PCR检测到CD133与CD24 mRNA表达;结果显示肾积水患者肾实质组织中CD133mRNA表达较瘤旁肾实质组织明显降低(P=0.032);WB结果提示与肾积水肾实质组织相比;肾母细胞瘤肿瘤组织Piwil2 (P=0.022)、Piwil4 (P=0.022)蛋白表达明显增高。 ③肾母细胞瘤患者、肾积水患者、健康人尿液细胞外囊泡中均检测到Piwil2、Piwil4与CD133蛋白的表达;其中肾积水患者患侧uEVs CD133蛋白水平显著高于健侧(P=0.025)。 结论 ①差速离心法与重水-蔗糖垫法均可有效分离尿液细胞外囊泡;但Tris-Hcl重悬的重水-蔗糖垫法可显著提高囊泡分离效果。 ②组织中的Piwil2、Piwil4蛋白表达可能与肾母细胞瘤恶性程度有关;但尿液细胞外囊泡中Piwil2、Piwil4蛋白表达与组织表达不一致;尚不能作为评估肾母细胞瘤恶性程度的指标;而尿液细胞外囊泡中的CD133蛋白表达情况可能与肾小管上皮的再生修复能力有关。