研究背景:肿瘤成为了目前威胁人类生命的最主要的疾病类型,发生率死亡率逐年增加,其中视网膜母细胞瘤(Rb)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤,在我国小儿视网膜母细胞瘤发病率为1100～1500/年,预后差。它是一种来源于光感受器前体细胞的恶性肿瘤,常见于3岁以下儿童,具有家族遗传倾向,可单眼、双眼先后或同时罹患。目前针对视网膜母细胞瘤的治疗手段中,单纯放射治疗即可治愈早期Rb,所以早期发现和诊断Rb至关重要。从发病机制上看,位于13q14抑癌基因Rb1,双等位基因同时突变、失活,导致视网膜母细胞瘤发生。单基因功能失活这一特点,成为了基因工程方法构建视母细胞瘤模型的重要基础;近年来,利用转基因技术,基因编辑技术分别构建了啮齿类动物,两栖类动物以及在人类胚胎干细胞水平的 Rb 模型。其中 CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repea/CRISPR-associated nuclease 9)基因编辑系统是基于古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的一种新型的基因编辑技术。利用CRISPR系统进行基因编辑实验应用广泛,对于单基因功能性的研究提供了有效的工具。CRISPR系统在肿瘤模型建立中起到了关键的作用,通过对原癌基因及抑癌基因的编辑,使得肿瘤发生发展,为研究肿瘤的发生发展机制提供了条件,也为临床治疗肿瘤提供理论指导和支持,为治愈肿瘤提供可能。CRISPR系统具有更加高效、操作简单、细胞毒性小等特点,成为了目前最佳的构建该模型的基因编辑手段。研究目的:近年来,对于Rb1抑癌基因的研究逐渐深入,从啮齿类动物到两栖类动物(如非洲爪蟾)再到人类的胚胎干细胞,构建Rb1基因敲除动物模型,分析了不同物种的Rb1基因功能及该基因失活对于机体形成视网膜母细胞瘤的影响。但是目前研究者成功构建的Rb1基因敲除模型还不能很好地模拟人类视网膜细胞瘤的发病机制及表型。所以,鉴于人类和非人灵长类的相似性,我们利用非人灵长类即食蟹猴为研究对象,在其细胞及胚胎水平进行Rb1基因编辑,来获得敲除效率及敲除后蛋白表达影响,并构建视网膜母细胞瘤模型,进一步研究视网膜母细胞瘤的发生发展机制及治疗方法。研究方法:本实验共分为两个部分:第一部分在细胞水平测试针对食蟹猴Rb1基因设计的sgRNA编辑效率及脱靶位点预测分析;第二部分进行食蟹猴胚胎基因编辑,转入代孕母体以获取子代个体。进一步研究Rb1基因失活与视网膜母细胞瘤发生发展的关系。第一部分:选择CRISPR编辑系统作为基因编辑工具,以非人灵长类食蟹猴成纤维细胞作为实验对象。首先进行细胞建系及细胞扩大培养,达到所需细胞量后,然后以培养的食蟹猴成纤维细胞为实验材料,设计sgRNA和SpCas9共转染目的细胞,提取靶细胞基因组,设计包含Rb1基因8号外显子区的DNA引物进行编辑后细胞基因组扩增,挑选单克隆质粒载体,进行序列测定,分析基因敲除效率。然后提取成功敲除Rb 1基因基因组的细胞蛋白,进行WB实验分析转录水平敲除效果,并最终对Rb1基因敲除效率和脱靶效率进行研究。第二部分:利用CRISPR编辑技术,按照一定比例配置sgRNA和SpCas9混合液;利用激素刺激雌性食蟹猴超排,获取成熟卵细胞,并进行单精子注射,在卵细胞受精前,进行显微操作将sgRNA和SpCas9混合液注入卵细胞内,培养单细胞胚胎至四细胞期,终止培养,提取胚胎基因组,分析每个不同胚胎Rb1基因敲除效率,以及每个胚胎的单细胞的基因敲除类型。进一步构建Rb1基因敲除胚胎,转移编辑胚胎至代孕母体。研究结果:第一部分:以食蟹猴成纤维细胞为实验对象,分别设计6条sgRNA在细胞水平进行Rb1基因编辑,得到CRISPR/Cas9编辑技术对于Rb1基因敲除效率为Rb1-sgRNA-8-1:75%;Rb1-sgRNA-8-2:85%,其余 gRNA 无编辑效果,WB 检测细胞蛋白表达量明显下降甚至不表达。脱靶分析未发现可检测脱靶位点。第二部分:分别在受精前Oh及-2h注射RNP到卵细胞胞质内,针对Rb1-sgRNA-8-1,获得编辑胚胎11个(其中0h 6个;-2h 5个)发生基因敲除的胚胎所占比例分别为33.3%和40%,4-cell均被编辑的胚胎所占比例为33.3%和20%。针对Rb1-sgRNA-8-2,获得编辑胚胎26个(其中Oh 13个;-2h 13个),发生基因敲除的胚胎所占比例分别为84.62%和61.54%,4-cell均被编辑的胚胎所占比例为53.85%和23.08%。注射RNP胚胎15个并继续培养至囊胚,然后将其中5个胚胎移植入代孕母体,使其成功受孕。结论:针对食蟹猴细胞及胚胎的基因编辑研究,CRISPR/Cas9基因编辑系统可以作为有效手段,并且编辑效率较高;单sgRNA转染RNP方式可以获得较高效率的基因敲除胚胎,并且发生嵌合几率降低;成功获得囊胚率较高的基因编辑胚胎并移植。