论文部分内容阅读
目的:观察香加皮杠柳苷(periplocin extracted from cortex periplocae, CPP)对人结肠癌细胞株SW480在体内外增殖的抑制作用,研究其对SW480细胞内Wnt/β-catenin信号转导通路的调控作用和对β-catenin/TCF下游靶基因的影响,以探讨CPP的抗肿瘤作用机制,为CPP作为抗肿瘤药物开发提供理论依据。方法:1采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度CPP(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μg/ml),处理不同时间(24、48和72小时)对SW480细胞增殖反应的抑制作用。2采用光镜及透射电镜(TEM)观察CPP作用后,细胞形态学变化。3采用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测CPP(0.5μg/ml)作用不同时间(0、6、12和24小时),SW480细胞凋亡变化和细胞周期分布情况。4免疫荧光和激光共聚焦显微镜( laser scanning microscope, LSM)观察CPP(0.5μg/ml)作用12h后,SW480细胞内β-catenin蛋白的亚细胞定位改变。5采用免疫印迹(western blot)方法检测不同浓度CPP(0、0.125、0.5、2.0μg/ml)作用24小时后,SW480细胞总蛋白、细胞浆蛋白及细胞核蛋白β-catenin表达变化。6采用电泳迁移率改变(EMSA)方法分析不同浓度CPP(0、0.125、0.5、2.0μg/ml)作用24小时后,SW480细胞TCF复合物与其特异性DNA结合序列结合能力变化。7采用逆转录-聚合酶链反应(revers transcription PCR,RT-PCR)半定量检测不同浓度CPP(0、0.125、0.5、2.0μg/ml)作用24小时后,SW480细胞β-catenin、survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表达变化。8建立人结肠癌细胞SW480裸鼠移植瘤模型,12只实验裸鼠随机分为CPP处理组和对照组。CPP处理组小鼠于瘤旁注射CPP(30 mg/kg),每日1次,对照组小鼠于瘤旁注射生理盐水(NS),每隔3天测定肿瘤大小1次,用药12天后引颈处死裸鼠,完整剥离瘤体,分别称瘤重、测体积,计算抑瘤率。9 HE染色光镜下观察移植瘤组织学形态变化。10免疫组织化学技术检测两组肿瘤组织中β-catenin、survivin及c-myc蛋白表达的变化。结果:1 CPP在0.125~2.0μg/ml浓度范围内能明显抑制结肠癌细胞SW480体外增殖反应(P<0.01),抑制率呈明显的浓度和时间依赖性,其中2.0μg/ml CPP作用72h的抑制率最高,达到91.71%。2 CPP作用后,SW480细胞发生典型的凋亡形态学和超微结构改变。3流式细胞技术检测结果显示,CPP可诱导SW480细胞发生G0/G1期阻滞(由17.54%上升至37.87%),并产生明显的细胞凋亡,以0.5μg/ml CPP作用24h时的凋亡率为最高,达到36.52%。4免疫荧光染色结果显示,SW480细胞β-catenin蛋白以胞核和胞浆分布为主,绿色荧光密集点状分布于胞核与胞浆内;CPP作用后,β-catenin蛋白在胞浆的相对表达量明显多于胞核。5 Western blot分析结果显示,经不同浓度CPP处理24小时后,SW480细胞总蛋白、胞浆蛋白和胞核蛋白中的β-catenin分子表达水平均明显降低(P<0.05)。6 EMSA分析结果显示,不同浓度CPP作用24小时后,SW480细胞TCF复合物与其特异性DNA结合序列结合活性下降。7半定量RT-PCR检测结果显示,经不同浓度CPP处理24h后,SW480细胞中β-catenin mRNA表达水平无明显变化,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),而β-catenin/TCF下游靶基因survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表达水平随作用浓度的增加而降低,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。8成功地建立了人结肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤模型,成瘤率为100%。CPP处理组平均瘤体积为0.515±0.184 cm3,平均瘤重为1.367±0.398 g,抑瘤率为61.41%,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。9经HE染色光镜下观察结果显示,CPP处理组荷瘤小鼠肿瘤组织中可见较多量炎性细胞浸润及均匀红染无结构的坏死区。10免疫组织化学检测结果显示,两组移植瘤组织均有β-catenin、survivin和c-myc蛋白表达,并且与对照组相比,CPP处理组的各蛋白表达均有不同程度减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1 CPP在一定浓度范围内,能明显抑制结肠癌细胞SW480的体外增殖,具有明显的量效和时效关系;其对SW480细胞的抑制作用可能与其诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞有关。2 CPP可抑制SW480细胞Wnt/β-catenin信号转导通路。其机制可能是改变β-catenin分子的亚细胞定位、降低了细胞总蛋白、胞浆蛋白和胞核蛋白中的β-catenin分子表达,抑制TCF复合物与其特异性DNA结合序列结合活性,使β-catenin/TCF转录活性降低。3 CPP抑制SW480细胞β-catenin/TCF下游靶基因survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表达,而β-catenin mRNA表达水平未见明显改变,说明CPP对细胞β-catenin的调节不在mRNA水平,而很可能在蛋白降解水平;其下游靶基因survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表达降低,与CPP诱导SW480细胞凋亡并发生G0/G1期阻滞相一致。4 CPP能够抑制SW480细胞的裸鼠移植瘤生长,CPP处理组瘤组织可见较多量炎性细胞浸润及均匀红染无结构的坏死区。5 CPP能够减少裸鼠移植瘤组织中β-catenin、survivin和c-myc蛋白表达。6 CPP在体内外能够明显抑制SW480细胞增殖,其作用机制与抑制Wnt/β-catenin信号转导通路有关。