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二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）是一种对人体具有促进和维护神经系统,预防心血管疾病,抗炎、抗癌等多种功效的ω-3族多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid,PUFA）。裂殖壶菌是高含DHA的单细胞真核生物。较之传统的鱼油DHA生产方法,通过发酵培养裂殖壶菌生产DHA的路径,具有更加生态环保、不受季节影响和生产原料限制、油脂无鱼腥味等优势,已开始应用于DHA工业化生产,并将逐步成为主要的DHA来源。鉴于裂殖壶菌基因组较大,合成DHA的代谢途径机理尚未完全明了,本文在裂殖壶菌发酵过程菌体形态变化与DHA合成关联性研究的基础上,设计了菌种理化诱变后通过二阶筛选高DHA产率的育种方法,并探索了DHA产率提高的机理,最后基于以上结论,进行了发酵的优化。主要结果如下:1.根据扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）显微观察细胞形态变化和通过荧光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,LSCM）染色跟踪胞内脂质体积累规律,将发酵过程划分为菌体适应期、快速增长期、脂质积累期和脂质反耗期四个阶段,发现了不同发酵阶段细胞的繁殖方式、胞内脂质体分布和脂肪酸合成优势途径的差异,即在快速增长期,细胞以二分裂增殖方式为主,脂质体均匀分布于细胞质内,此阶段脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）产物逐步增加,而聚酮合酶（polyketide synthase,PKS）产物呈下降趋势;当发酵进入脂质积累期,细胞主要以孢子囊的形式存在,脂质体相互融合并增大体积,此时PKS产物相对比例开始上升而FAS产物开始减少。通过对细胞结构变化进行显微跟踪观察,将细胞形态与发酵主要参数相关联,用于在发酵过程中快速、准确地判断菌体所处的发酵阶段,建立了研判裂殖壶菌发酵过程产DHA关键节点的简易方法。2.以常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）诱变细胞,设计了先筛选高含油量菌株,再筛选高DHA组分菌株的理性筛选方法。通过测试紫外（ultraviolet,UV）、甲基磺酸乙酯（ethylmethylsulfone,EMS）和ARTP三种诱变方法对Schizochytrium sp.S31的诱变效果,发现以ARTP诱变S31细胞,正突变率高,诱变后菌株传代稳定,因此确定ARTP作为诱变手段。同时,基于分段提高裂殖壶菌含油量和DHA含量比,最终实现DHA产率倍乘提升的思路,设计了首轮ARTP诱变辅以琥珀酸脱氢酶竞争性抑制剂丙二酸（malonic acid,MA）筛选,得到含油量提高的变异株,再以此为基础进行第二轮诱变,以糖肽抗生素博莱霉素（zeocin）筛选高DHA含量比的变异株,最终获得DHA高产株mz-17。250-mL摇瓶发酵的结果,mz-17的含油量、DHA含量和DHA产率达到了59.5%,44.2%和27.2%,较出发菌株分别提高了30.8%,和22.1%和87.6%。3.对高产DHA突变株mz-17与出发菌株S31进行比较转录组分析,从碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂肪酸合成途径和磷酸化水平四个层面,对这两个菌株在发酵快速增长期和脂质积累期的差异表达基因（differencially expressed gene,DEG）进行分析比较,揭示了mz-17高产DHA的相关机理。相比较于出发株,mz-17在发酵过程中糖酵解（glycolytic pathway,EMP）途径、亮氨酸（leucine,Leu）和异亮氨酸（isoleucine,Ile）降解途径得到了增强,特别是在油脂积累期,log2 ratio介于1.08和1.58之间,增加了乙酰CoA的积累;同时,磷酸戊糖途径（hexose monophosphate pathway,HMP）、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle,TCA）、Leu和Ile合成途径、缬氨酸（valine,Val）降解途径明显的受到了抑制,在24 h时log2 ratio均小于-1,减少了乙酰CoA的非脂肪酸合成消耗。此外FAS途径相关基因表达的下调（log2 ratio<-1）和PKS途径相关基因表达的上调（log2 ratio>1）,使脂肪酸的合成偏向于产多不饱和脂肪酸（PUFA）,积累更多的DHA。最后,mz-17的氧化磷酸化水平受到抑制,相关酶基因表达下降最大达到log2ratio=-4.03,提高了低溶氧的耐受能力,为脂肪酸PKS合成途径提供了优势。4.基于高产株mz-17的发酵特性与代谢途径的基因表达差异,对DHA发酵的促进因子、pH条件和发酵罐溶氧水平进行了优化调控。建立了发酵不同时期添加Fe2+的策略,即在发酵前48 h,控制Fe2+浓度为1.0 mmol·L-1,48 h后补加Fe2+至1.5 mmol·L-1。使mz-17的DHA产量提高了18.9%;同时,考察了pH对菌体生长和油脂积累的不同影响,提出了两阶段pH调控策略,即发酵前60 h控制pH为7.0,后60 h调整pH至5.0,使mz-17发酵的DHA产量达到了19.7 g·L-1,提高了22.2%;最后,针对转录组分析中mz-17氧化磷酸化水平降低的现象和DHA合成的PKS途径无需耗氧的特点,设计了溶氧逐步降低的调控策略,即在发酵48 h和60 h分别将DO从40%降至20%和5%。通过该DO调控策略,发酵过程生物量、含油量和DHA含量均有所增加。最终DHA产量比DO调控优化前提高了15.6%。综合了上述各项调控方法后,mz-17的DHA产量提高到22.8 g·L-1,比发酵调控前高出68.0%。