家蚕是重要的经济昆虫和模式昆虫，其转基因技术的研究在培育新品种、生物反应器的开发以及功能基因组学研究等方面具有重要应用价值。本文通过对家蚕精子介导转基因技术体系诸多影响参数进行了优化研究，初步构建了理想的家蚕精子介导转基因技术体系，同时也对家蚕人工授精的关键环节进行了优化研究，为后续相关工作的开展建立了良好的平台。 1．家蚕精子介导转基因技术体系的优化对采用piggyBac转座载体的家蚕精子介导转基因技术进行了系统参数优化。针对可能影响精子介导基因转移效率的诸多因素如外源DNA注射方式、外源DNA载体类型、外源DNA浓度、外源DNA稀释剂等，采用PCR技术等分子生物学方法，在G0代的蚁蚕期、五龄期、蛹期、蛾期和G1代的蚁蚕期、四龄期、蛹期性蛾区的幼虫期、蛹期和成虫期个体基因组进行了GFP检测，综合分析了各种参数对基因转移效率的影响。 （1）注射方式的优化采用piggyBac转座子载体通过对先注后交、先交后注以及人工授精三种方式所得的GO代家蚕的蚁蚕以蛾区为单位进行了GFP的PCR检测。三者的GFP阳性蛾区率依次为：77.8％、40％、30％，先注后交为最高，同时先注后交操作也较为方便，因此先注后交的方式最为理想。 （2）外源DNA稀释剂的优化分别选用dd H2O、TC-100、1×TE和0.1×TE作为外源DNA的稀释剂，探讨了稀释剂对受精和基因转移效率的影响。四种稀释剂对家蚕受精率均无明显影响。稀释剂这类对于G0代蚁蚕GFP阳性蛾区检出率影响较大，其中以0.1×TE作为外源DNA的稀释剂最为理想，GFP阳性蛾区检出率达77.8％。而用TC-100处理的则未能检出阳性蛾区，表明TC-100对精子介导效率有强烈抑制作用。 （3）外源DNA浓度的优化探讨了在先交后注与先注后交的条件下，外源DNA的浓度对G0代蚁蚕GFP阳性蛾区检出率的影响。结果表明当浓度为2g/L时最为理想，蚁蚕的阳性蛾区检出率最高达100％。 （4）不同载体质粒对G0代基因导入效率的影响用先注后交的方法比较了含有转座酶辅助质粒的piggyBac转座载体pPIGA3GFP及pHA3PIG、无家蚕基因组同源序列的非转座质粒pGEM4Z-ie1-gfp的导入效果。结果表明，G0代蚁蚕的外源DNA阳性检出率并非总是piggyBac转座载体比非转座质粒高，它们之间无规律性差异。可以认为，家蚕精子细胞对于吸附的外源DNA并没有序列特异性要求，精子携带进入胚胎的游离状态外源DNA可以存续至蚁蚕期。 （5）G0代、G1代不同发育时期外源DNA检出率的变化为了了解采用piggyBac转座载体的精子介导法导入的外源基因的降解及整合效率，从G0代蚁蚕期开始抽样和PCR检测，结果表明，GFP阳性蛾区率在G0代蚁蚕期高达60.3％，到5龄中期下降为7.9％，蚕蛾期阳性率与5龄期基本不变。推测由精子介导带入胚胎细胞但未能整合进入基因组的游离外源DNA在5龄期前基本被降解破坏，已经整合进入基因组的外源DNA可以通过其后的发育变态过程。 根据G0代5龄期和蛾期检测结果，选留阳性雌雄蛾所产的G1代，继续进行G1代蚁蚕混合抽样和4龄蚕个体的PCR检测。结果表明，G1代蚁蚕阳性蛾区率达到29.3％，4龄期GFP阳性蛾区率为20.0％，4龄期GFP阳性蚕个体所占比例为2.0％。表明本试验所采用的精子介导方案，不仅具有较高的外源基因导入效率，而且能够在胚胎发育的较早时期整合进入基因组，从而能够以较高的概率通过生殖细胞传递至后代。 （6）综合上述试验结果，我们推荐家蚕精子介导基因转移技术的技术方案为：处女蛾交尾囊先注射6-8μL 以0.1×TE 稀释的2g/L 转座子载体DNA后，正常交配产卵，根据G0代5龄期及蛾期PCR检测标志基因阳性蛾区自交，G1代蚁蚕阳性蛾区的阳性蚕蛾自交，以获得纯合后代。 2．家蚕人工授精关键技术的优化家蚕人工授精技术的关键是精子细胞的采集与预处理。通过优化，初步建立了交配囊挤压结合离心的家蚕精子细胞高效采集技术，基本满足实验研究需要。2人解剖操作，每小时可取得精液100μL左右。采用500rad/min×1～2min离心，对精细胞的损伤小，显微镜观测精子细胞活率达80％以上。精液的纯度好，家蚕的受精率平均达76.5％。