[目的]基孔肯雅热（Chikungunya Fever,CHIKF）是以伊蚊作为传播媒介,由基孔肯雅病毒（Chikungunya Virus,CHIKV）感染引起的急性传染病,临床症状主要表现为发热、关节疼痛、皮疹。病死率较低,但其持续性后遗症给感染者以及国家带来巨大的经济损失。另外,基孔肯雅热和登革热具有相同的传播媒介和相似的临床特征,临床上会误诊疾病,导致耽误治疗的严重后果。因此,有效地预防和及时准确地诊断基孔肯雅热,不仅可以阻止疾病的发生发展,而且能节省了医疗资源。疫苗和诊断试剂是防控传染病的有效手段,在疾病的预防、诊断、治疗方面具有重大作用。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）和病毒亚单位重组蛋白是疫苗及诊断试剂的关键组成部分,本论文研究主要通过昆虫细胞杆状病毒和原核表达系统制备基孔肯雅病毒主要抗原,包括基孔肯雅病毒全结构蛋白和E2蛋白,以期为基孔肯雅热的预防和诊断奠定基础。[方法]为了获得基孔肯雅病毒的主要抗原蛋白,本论文研究分别用昆虫细胞和原核细胞系统表达抗原蛋白。（1）昆虫细胞-杆状病毒系统表达:首先将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因序列（C-E3-E2-6K-E1）根据昆虫细胞对密码子的偏好性进行优化,然后通过人工方法合成基因片段,经无缝克隆方法将合成的基因片段克隆至昆虫细胞杆状病毒表达载体中,并用酶切和测序方法进行验证。重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组杆状病毒杆粒（Bacmid）。采用无内毒素大提试剂盒提取重组杆状病毒杆粒,使用不同用量Bacmid和不同体积转染试剂转染ExpiSf9昆虫细胞,优化转染条件以提高转染效率。以获得的重组杆状病毒感染ExpiSf9昆虫细胞表达基孔肯雅病毒结构蛋白。通过细胞超薄切片验证杆状病毒的产生和流式细胞仪测定病毒滴度、间接免疫荧光和蛋白免疫印迹分析目的蛋白表达,并通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒样颗粒。最后用透射电镜鉴定病毒样颗粒的形态大小和纯度。（2）原核表达系统表达:将基孔肯雅病毒结构蛋白E2基因根据原核细胞密码子的偏好性进行优化,然后通过人工方法合成基因片段,克隆至原核表达载体。经测序验证正确后,转化BL21（DE3）pLysS感受态细胞;经不同浓度的IPTG和不同温度诱导优化后,表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹分析进行验证。最后通过免疫小鼠以验证表达抗原的免疫原性。[结果]通过以上方法的实施,获得了如下研究结果:（1）昆虫细胞杆状病毒表达系统:酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了含基孔肯雅病毒结构蛋白（CHIKV-SP）的杆状病毒重组质粒（pFastBac l-CHIKV-SP）。重组质粒转化DH10Bac后,PCR结果表明获得重组杆状病毒杆粒（rBE-CHIKV-SP）。优化和流式细胞分析结果表明,4ug重组杆状病毒杆粒和10ul转染试剂进行转染,能获得较高的病毒滴度。免疫印迹分析表明,目的蛋白在昆虫细胞内得到了表达。免疫荧光分析发现,基孔肯雅病毒结构蛋白表达在昆虫细胞胞质内。蔗糖密度梯度离心纯化时发现,形成的VLPs颗粒主要在35%蔗糖层。电子显微镜结果表明颗粒的大小在40-70nm之间,其中60nm-70nm颗粒占81%,和野生型病毒粒子大小相似。（2）原核细胞表达系统:酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了含基孔肯雅病毒包膜蛋白E2（CHIKV-E2）的重组原核表达质粒（pGEX-6P-1-CHIKV-E2）。SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明,成功地表达了重组蛋白,然而,表达蛋白的90%以上存在于包涵体中。表达的蛋白用于免疫小鼠以检测其免疫原性,ELISA结果表明,表达的蛋白在小鼠中能够诱导高达1:102400的特异性抗体产生,这提示表达的基孔肯雅病毒E2抗原具有较好的免疫原性。[结论]综上所述,本论文研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统成功地制备了纯度较高和均一性较好的基孔肯雅病毒样颗粒;通过原核表达系统制备了基孔肯雅病毒的抗原E2蛋白,并获得高效价的多克隆抗体。因此,本论文研究不仅获得了基孔肯雅病毒的主要抗原,为基孔肯雅热的诊断试剂和疫苗研发奠定了基础,也建立了昆虫细胞杆状病毒表达系统和原核细胞表达系统,为实验室将来开展其它病原体的抗原表达建立了平台。