β-内酰胺类抗生素是治疗细菌感染性疾病最重要的药物之一。β-内酰胺类抗生素在临床、农业和畜牧业方面的过度使用,导致大量的耐药细菌产生。细菌产生耐药性最重要的机制之一是生产金属β-内酰胺酶(Metallo-β-lactamases,MβLs)水解β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环使其失去活性。MβLs水解几乎所有已知的β-内酰胺类抗生素,但迄今尚无任何可用于临床的酶抑制剂。为了应对细菌的耐药性,科学家们一直致力于研究MβLs的结构及其催化机理。基于这一理念,本文首先对三个组群具有代表性的金属β-内酰胺酶CcrA,NDM-1,VIM-2,IMP-1,ImiS和L1进行了表达和纯化,并对其进行了凝胶电泳和紫外表征。在获得纯化的酶样品之基础上,制备了去金属蛋白(apo-MβLs),进而重组NDM-1并对其进行了活性表征。为进一步研究MβLs的结构和其作用机理,本文首次应用等温滴定微量热仪(ITC)表征了 MβLs对Zn(Ⅱ)离子的键合机制,测定了三个亚组MβLs键合Zn(Ⅱ)离子的模式,得到了一系列重要的热力学参数,包括酶/抑制剂分子的化学计量数(N),离解常数(Kd),反应焓变(△H),反应熵变(△S)。此外,通过ITC技术制备了单核和双核物种ZnCcrA,ZnZnCcrA,ZnNDM-1和ZnZnNDM-1,测定了其对头孢类和碳青霉烯类抗生素的催化活性。发展了一个ITC方法,对耐药细菌活菌体内的MβLs进行了实时活性监测与抑制,评价了酶抑制剂EDTA、D-卡托普利、唑基硫代乙酰胺和依布硒对产MβLs耐药细菌的抑制效能,进而研究了源于临床的不同耐药细菌水解抗生素头孢唑林的热效应,取得了重要的科学数据和结论。本文发展的ITC技术,为研究复杂生物网络环境中金属酶的结构及其功能提供了新途径。