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本课题用Red同源重组技术敲除鸭源大肠杆菌标准菌株(073)多重耐药调控基因mar A,构建marA基因缺失突变株(O73△AmarA),并采用微量稀释法测定5种抗生素对其的最小抑菌浓度。应用荧光定量PCR方法,检测O73、O73△AmarA及其不同药物诱导时有关主动外排基因、调控基因的mRNA相对表达量,旨在探讨多重耐药耐性产生及其调控机制。利用PCR扩增两翼与目的基因上下游同源、含有卡那霉素抗性基因片段,电击转化073/46。在L-阿拉伯糖诱导下,含有质粒pKD46的菌株073表达λ噬菌体的3个重组蛋白,在Red同源重组系统表达重组酶的帮助下,含卡那抗性基因的PCR产物通过其两侧的marA基因同源序列与鸭大肠杆菌染色体上的marA基因发生同源重组,通过卡那霉素抗性平板筛选得到因性克隆,结合PCR扩增和测序鉴定,证明△marA突变株止确构建。还利用PCR分别扩增O73marA基因的上下游序列和质粒pkD4的卡那抗性基因,分别连接T载体pET-28,再通过酶切连接的方法分别将marA基因的上、下游连接到pET-28-kan质粒上,构建同源重组质粒PET-28-marA,同源重组质粒转化DH5α扩增后,提取质粒双酶切获得同源重组片段将同源重组片段电转化至O73中,利用含有同源臂的卡那霉素抗性片段分别替换目的基因marA。则定073和O73△AmarA对的MIC值。庆大霉素、头孢噻呋、恩若沙星、多西环素对O73△AmarA的MIC值较073显著下降，对073的MIC值分别为2、2和4μg/mL,对O73△AmarA的MIC值分别为0.125、0.125、0.5μg/mL。庆大霉素、头孢噻呋、氟苯尼考、恩若沙星、多西环素五种药物诱导培养标准菌株073和缺失株073ΔmarA至40代,通过荧光定量PCR检测有关主动外排基因和调节基因mRNA相对表达量。结果表明：未经药物诱导的标准菌株敲除前与敲除后,acrA, acrB, TolC,acrD, acrE, acrF, soxS, rob A基因mRNA的相对表达量均有所下降介于(0.04-0.74之间)。其中acrD基因的相对表达量为0.04,下降最高；而acrE基因的相对表达量为0.74,下降最低。073经5种药物诱导后,其主动外排基因mRNA的表达量大多上升,其相对表达量介于0.12-2.73之间。其中,经多西环素诱导至高度耐药时,tolC基因的相对表达量为2.43,上升2倍。073经头孢噻呋诱导至高度耐药时,acrE基因的相对表达量为0.12,下降最高。acrA、acrB、TolC、 acrD、acrE、acrF、soxS、rob A基因与未经药物诱导的标准菌株相比较,相对表达量均未显著的变化。O73△AmarA经以上药物诱导后,各主动外排基因mRNA的相对表达量介于1.50-55.33之间。O73△AmarA经头孢噻呋诱导后,acrF基因的相对表达量为1.50,上升最低,上升1.5倍；经恩若沙星诱导后,tolC基因的相对表达量为55.33,上升55倍。与标准菌株相比较,敲除株O73△marA诱导后,其主动外排基因的表达量显著上升。acrA、acrB、TolC、acrD、 acrE、acrF、soxS、robA的相对表达量较未诱导的标准菌株分别上升55、20、16、43、16、25、17、19倍,较O73△marA未诱导时上升251、57、30、464、23、27、72、76倍。073、O73△marA在庆大霉素诱导前后,8种主动外排基因、2种调控基因mRNA相对表达量水平比较：073诱导到高度耐药(40代)时与073标准菌株接近,O73△marA秀导株(40代)远高于未诱导株O73△marA。其它主动外排基因和调控基因如soxS也有相似的规律。