在哺乳动物个体发育中，神经系统的发育是一个非常复杂的过程。其中，神经元分化对于神经系统的形成是非常重要的。神经元分化过程中，信号分子与细胞增殖、细胞周期、细胞分化紧密协调，调控神经细胞的发育与成熟。探讨神经元分化调控的分子机制对于神经发育、神经再生、神经系统退行性疾病，以及脑肿瘤的发生发展和治疗有重要意义。　　拓扑异构酶IIβ（Topoisomerase IIβ，Topo IIβ）是促进神经发育和神经元分化的关键蛋白质。腺病毒E2转录结合因子-1（E2F1）是一个重要的转录因子，在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化进程中，发挥着重要作用。西洛他唑（cilostazol，CLZ）是抗血小板类药物，对神经元损伤有保护作用，而且最近有研究报道 CLZ可干扰 E2F1与其靶基因的结合，促进神经元分化，但其确切作用机制尚不明确。因此，本研究以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元分化模型，通过外源性上调E2F1的表达，检测细胞分化过程中E2F1和Topo IIβ的表达变化，进而探讨神经元分化的分子机制，为临床神经系统疾病的研究与治疗提供一些依据。本研究共分三部分。　　第一部分：E2F1对维甲酸诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化的影响　　目的：　　研究转录因子E2F1转染SH-SY5Y细胞后，观察其对细胞生长状况的影响，以及与维甲酸（Retinoic acid，RA）诱导神经元分化之间的关系。　　1.细胞培养：SH-SY5Y细胞以DMEM培养基培养，置37℃、饱和湿度、5％CO2环境下培养，待细胞进入对数生长期后进行实验操作。　　2.E2F1质粒转染：E2F1过表达质粒用 Lipofectamine2000转染SH-SY5Y细胞，倒置荧光显微镜、qRT-PCR以及Western blot观察转染效率。　　3.诱导分化：E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞后，加入维甲酸（RA）10μmol/L诱导分化3d。　　4.细胞生长状况检测：MTT检测转染前后细胞生长指数，并绘制生长曲线，倒置显微镜观察转染前后细胞分化形态。　　5.细胞周期检测：收集各组细胞，流式细胞术检测G0/G1、S和G2/M期细胞百分比。　　6.各组细胞神经元分化的鉴定：神经元突起生长的检测；MAP2表达的免疫荧光及蛋白印迹检测。　　7.统计学方法：实验结果以x±s表示，单因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05为有显著性意义。　　结果：　　1.SH-SY5Y细胞呈贴壁、簇状生长，胞体小而圆，大多数为不规则形，少数呈梭形，有较短的神经突起。　　2.倒置荧光显微镜、qRT-PCR以及Western blot检测转染效率　　E2F1过表达质粒带有绿色荧光，Lipofectamine2000转染E2F1过表达质粒进入 SH-SY5Y细胞1d、2d、3d后，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，从而判断转染效率在80%以上。转染后提取E2F1总RNA及总蛋白，采用qRT-PCR以及Western blot技术检测，在E2F1过表达细胞中 E2F1的mRNA及蛋白水平都有显著增高，与未转染组和空载体组相比，有显著性差异（P<0.05）。说明过表达 E2F1质粒已经成功转染进入SH-SY5Y细胞。　　3.细胞生长状况　　SH-SY5Y细胞转染E2F1过表达质粒后，MTT结果显示：与对照组（Con）相比，E2F1过表达组（over）细胞生长最快，二者有显著性差异（P<0.05）。转染后加入10μmol/L RA诱导分化，诱导组（Con+RA）与对照组（Con）相比，细胞生长速度明显降低，而E2F1过表达组加入RA后（over+RA），生长速度没有明显降低，与对照组没有显著性差异。　　4.细胞分化形态学变化　　E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞，加入或不加10μmol/L RA诱导分化，3 d后倒置显微镜下观察：RA未处理组中，过表达组（over）细胞形态与对照组（Con）相比，无明显区别；在RA处理组中，与未诱导组相比，RA诱导分化组细胞数目减少，胞体聚集生长，神经突起长度明显增长。对单个细胞平均神经突起长度测量，结果显示：Con+RA组与Con组相比，有显著性差异（P<0.05）；而over+RA组的SH-SY5Y细胞突起长度增加不明显。　　5.转染E2F1过表达质粒对细胞周期分布的影响　　E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞后，流式结果显示：E2F1过表达组（over）G0/G1期细胞比对照组（Con）减少了7.354%，S期增加了5.071%，与对照组（Con）相比，二者有显著性差异（P<0.05），而空载体组（overC）与对照组（Con）相比没有显著性差异。转染后RA诱导细胞分化3 d，Con+RA组与Con组细胞相比，G0/G1期细胞明显增多，比Con组增加了23.597%，S期细胞明显降低，减少了28.410%，表明发生了G0/G1期阻滞（P<0.05）；over+RA组与Con组细胞相比，G0/G1期细胞增加了8.224%，S期减少了9.942%（P<0.05）。提示RA可诱导细胞周期阻滞，过表达E2F1可促进细胞周期进程。　　6.神经元分化的鉴定　　采用神经元分化标志分子，微管相关蛋白2（microtubule-associated protein2，MAP2）鉴定神经元分化。免疫荧光染色结果表明，E2F1过表达组（over）与对照组（Con）相比，MAP2的表达较弱；10μmol/L RA处理SH-SY5Y细胞后，MAP2不仅在细胞质中的表达增加，而且在神经元的突起中表达也明显增加，Con+RA组与 Con组细胞相比，有明显增加。而over+RA组MAP2表达量较低，与Con组相比，没有明显区别。Western blot检测MAP2表达，显示的结果与免疫荧光结果一致。　　结论：SH-SY5Y细胞经10μmol/L RA诱导可使细胞脱离细胞周期，并向神经元分化；E2F1过表达可促进SH-SY5Y细胞增殖，降低神经元分化；研究结果表明，细胞内E2F1水平可影响神经元分化，其具体机制尚需进一步研究。　　第二部分：E2F1通过负调控Topo IIβ表达抑制SH-SY5Y细胞向神经元分化　　目的：检测E2F1和Topo IIβ表达对SH-SY5Y细胞向神经元分化的影响。　　方法：　　1.细胞培养：SH-SY5Y细胞以DMEM培养基培养，置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养。　　2.免疫荧光、qRT-PCR以及Western blot检测E2F1过表达质粒转染细胞后对Topo IIβ表达变化的影响。　　3.qRT-PCR和Western blot技术检测细胞周期相关蛋白p27、cyclinD1、CDK4、E2F1 mRNA及蛋白表达变化的影响。　　4.染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）检测E2F1在Topo IIβ基因启动子区的募集与结合。　　5.统计学方法：同第一部分。　　结果：　　1.转染E2F1过表达质粒对细胞中Topo IIβ表达变化的影响　　免疫荧光染色结果显示：Topo IIβ的表达在细胞核中，E2F1过表达组（over）与对照组（Con）相比，Topo IIβ的表达较弱，而空载体组（overC）与对照组（Con）相比没有显著性差异。10μmol/L RA诱导SH-SY5Y细胞后，Con+RA，overC+RA组与Con组细胞相比，Topo IIβ表达明显增加，而over+RA组Topo IIβ表达量低于Con组。qRT-PCR以及Western blot检测的结果与免疫荧光结果一致。　　2.qRT-PCR检测p27、cyclinD1、CDK4、E2F1 mRNA表达　　与对照组细胞相比，E2F1过表达组（over）的p27 mRNA表达量明显降低（P<0.05），而cyclinD1、CDK4、E2F1 mRNA的表达高于对照组（P<0.05）。空载体组（overC）与对照组（Con）相比没有显著性差异。RA诱导后，Con+RA、overC+RA组与Con组细胞相比，p27 mRNA表达明显增加（P<0.05），而over+RA组表达量低于Con组（P<0.05）；对于cyclinD1、CDK4、E2F1 mRNA的表达，Con+RA组低于Con组（P<0.05），而over+RA组高于Con组（P<0.05）。　　3.Western blot检测p27、cyclinD1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达与Con相比，over中p27蛋白的表达量明显降低（P<0.05），而　　cyclinD1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达高于Con（P<0.05），overC与Con相比没有显著性差异。RA诱导后，Con+RA、overC+RA与Con细胞相比，p27蛋白表达明显增加（P<0.05），而over+RA组的表达量低于Con组（P<0.05）；对于cyclinD1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达，Con+RA组低于Con组（P<0.05），而over+RA组高于Con组（P<0.05）。　　4.E2F1在转录水平负反馈调节Topo IIβ的表达　　ChIP检测显示，Topo IIβ基因启动子区有 E2F1的结合位点，E2F1过表达组中，结合在 Topo IIβ上的E2F1表达水平较对照组明显升高了（P<0.05）。RA诱导后，随着诱导分化时间的延长，特异性结合在Topo IIβ基因启动子区的E2F1逐渐减少，Con+RA组的表达量低于Con组（P<0.05），over+RA组高于Con组（P<0.05）。说明结合在Topo IIβ基因启动子区的E2F1与细胞的分化状态成反比，高表达的E2F1在RA诱导SH-SY5Y细胞分化过程中，通过抑制Topo IIβ的表达，抑制了细胞的分化。　　结论：　　RA诱导可降低SH-SY5Y细胞中E2F1的表达，诱导神经元分化，其作用与Topo IIβ的表达上调有关；细胞内E2F1水平增高可促进细胞周期相关蛋白的表达，抑制神经元分化；E2F1可作用于Topo IIβ基因启动子，在神经元分化进程中调控Topo IIβ表达；高表达的E2F1增强了其在Topo IIβ基因启动子区的募集，抑制Topo IIβ的表达，进而抑制神经元分化。　　第三部分：西洛他唑通过E2F1/Topo IIβ途径诱导神经元分化　　目的：　　探讨CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中，Topo IIβ的表达变化，以及E2F1/Topo IIβ途径对神经元分化的影响及其机制。　　方法：　　1.细胞培养：SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM培养基，置37℃、5%CO2培养箱内培养。　　2.MTT检测CLZ对SH-SY5Y细胞的作用浓度。　　3.细胞分化百分率检测：不同浓度的CLZ作用于人SH-SY5Y细胞，分别在0~5d观察、测量各组细胞突起长度的变化。以单个细胞总突起长度大于100μm作为细胞分化标准，计算细胞分化百分率。　　4.细胞分化形态学观察：30μmol/L CLZ作用于人SH-SY5Y细胞0~3 d，观察CLZ处理前后细胞形态学变化，检测分化情况。　　5.神经元分化的鉴定：免疫荧光及Western blot技术检测神经元分化标志蛋白MAP2的表达。　　6.Topo IIβ的表达：分别用免疫荧光、qRT-PCR技术以及Western blot检测Topo IIβ在CLZ处理前后的表达变化。　　7.qRT-PCR技术以及Western blot检测p27、E2F1、PCNA在mRNA和蛋白水平的表达变化。　　8.ChIP检测E2F1在Topo IIβ以及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）基因启动子区的结合。　　9.统计学方法：同第一部分。　　结果：　　1.MTT结果显示：不同浓度的CLZ（10、20、50、100、200、400μmol/L）作用于SH-SY5Y细胞1、2、3、4、5 d后可抑制细胞的增殖，随着CLZ浓度的增加和培养时间的延长，其对细胞增殖的抑制作用逐渐增大，与对照组相比，具有统计学意义（P<0.05）。提示CLZ对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性。应用半数抑制浓度（IC50）计算软件计算CLZ对SH-SY5Y细胞的IC50：第1~5 d分别为：167.472±6.289、76.334±2.549、36.629±3.148、31.382±2.148、28.146±1.485μmol/L。　　2.细胞分化百分率　　CLZ诱导细胞向神经元分化过程中，10、20、50μmol/L CLZ在1~3 d细胞分化百分率逐渐增加，第3 d达到最高，结合MTT计算的CLZ对SH-SY5Y细胞第1~5 d的IC50结果，因此选用30μmol/L CLZ诱导细胞分化3 d，进行以下实验。　　3.细胞分化形态学变化　　与对照组相比，CLZ诱导组细胞逐渐出现增殖速度下降，细胞数目减少，突起伸出，且突起数量和长度逐渐增加。诱导第3 d，细胞具有多个细长突起，且突起的长度明显增长，交织成网状，具备成熟神经元的形态特点，与对照组细胞相比有显著性差异（P<0.05）。　　4.神经元分化的鉴定　　免疫荧光检测MAP2表达情况，结果显示：30μmol/L CLZ诱导细胞向神经元分化3d后，突起长度明显增加，与对照组细胞相比有明显差异（P<0.05）。Western blot同样显示MAP2蛋白表达增高，与对照组细胞相比有显著性差异（P<0.05），说明30μmol/L CLZ可以诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。　　5.Topo IIβ的表达检测　　免疫荧光检测Topo IIβ表达情况，结果显示：CLZ诱导组细胞核染色明显加深，qRT-PCR、Western blot均显示Topo IIβ表达增高，与对照组细胞相比有明显差异（P<0.05）。　　6.p27、E2F1和PCNA的表达变化　　CLZ诱导细胞向神经元分化过程中p27在mRNA和蛋白水平均高于对照组细胞，有明显差异（P<0.05），而E2F1、PCNA均低于对照组细胞，有显著性差异（P<0.05），说明30μmol/L CLZ可以诱导细胞周期阻滞，抑制细胞增殖。　　7.CLZ影响E2F1在Topo IIβ和PCNA基因启动子区的结合　　ChIP检测显示，CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中，结合在Topo IIβ和PCNA基因启动子区的E2F1蛋白受到明显抑制（P<0.05）。提示：E2F1/Topo IIβ途径参与了CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化，CLZ促进了Topo IIβ的转录表达，抑制了细胞的增殖，促进了细胞的分化。　　结论：　　本部分研究以E2F1正向调控的靶基因PCNA作为对照，探讨了CLZ对E2F1和Topo IIβ表达的影响。结果提示，CLZ可通过抑制E2F1与Topo IIβ基因结合作用，诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化；从而进一步证明E2F1/Topo IIβ信号途径参与了神经元的分化，并为有关神经发育的研究，相关药物开发及有关神经系统疾病的治疗，提供了新的分子靶点。