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D-丙氨酸(D-Alanine)有杀菌、镇痛等作用,是一种重要的有机手性源,广泛应用于医药、食品、农药、化妆品等领域。目前工业生产制备D-丙氨酸的方法主要是酶拆分法,这种方法需要化学制备DL-丙氨酸衍生物,反应过程复杂。本论文旨在寻找一种廉价高效的生物酶法制备D-丙氨酸方法,即利用基因工程技术在原核和酵母表达系统分别重组表达了天冬氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶,并对双酶联合反应制备D-丙氨酸进行了考察。主要实验研究工作如下:1.在原核表达系统中重组表达了天冬氨酸消旋酶(AspR)和带His标签的D-氨基酸转氨酶(DaaT),并考察了双酶级联反应制备D-Ala工艺。AspR全细胞催化消旋反应的最佳条件:pH=7.0,温度40℃,底物L-Asp质量浓度为100 g/L。纯化后的DaaT酶液催化转氨反应的最佳条件:4 mmol/LPLP,pH=8.0,温度42℃,底物D-Asp与丙酮酸的摩尔比10:1,底物D-Asp质量浓度为25 g/L。AspR全细胞和DaaT纯化酶液级联反应制备D-Ala,催化25 mL 10%Asp,D-Ala 的产量可达 12.1 g/L。2.利用酵母表达系统分泌表达了天冬氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶,并考察了双酶偶联法制备 D-Ala 工艺。X-33/pPICZαA-DaaT 和 X-33/pPICZαA-AspR酵母基因工程菌分别用甲醇诱导发酵120 h,DaaT发酵上清目的蛋白浓度可达0.58 mg/mL,AspR发酵上清液浓缩十倍后目的蛋白浓度为0.12 mg/mL。用X-33/pPICZαA-AspR发酵上清和浓缩后的X-33/pPICZαA-DaaT发酵上清偶联反应制备D-Ala,催化1%L-Asp反应20 h,D-Ala产率为82%。3.建立了一种生物酶法级联催化高效制备D-Ala的工艺。分别对基因工程菌BL21/pET-Duet-AspR和X-33/pPICZαA-DaaT进行发酵条件优化。前者的最佳发酵条件为:30℃,pH 8.0,装液量25 mL/250 mL,摇床转速200 r/min发酵13 h。后者的最佳发酵条件为:温度30℃,pH 6.0,装液量75 mL/500 mL,转速250 r/min,每隔12 h补加甲醇至终浓度1.25%,发酵144 h。然后,用最优发酵条件下得到的AspR全细胞和DaaT发酵上清级联反应制备D-丙氨酸,D-丙氨酸产量可达14.47 g/L,用阳离子交换树脂分离得到D-丙氨酸6.7 g,收率78%,对映体过量值(ee值)=98%。