[目的]国际癌症研究机构（IARC）2018年发布的全球癌症统计数据《全球癌症报告》指出,肺癌的发病率和死亡率跃居世界首位,分别占癌症总发病人数和总死亡人数的11.6%和18.4%。肺腺癌是肺癌的主要亚型,侵袭和转移是其不良预后的主要原因。胆固醇代谢在肿瘤增殖转移中的作用成为目前肿瘤研究的热点之一,由于胆固醇代谢的复杂性,其作用也是莫衷一是。胆固醇代谢物作用的不一致性可能解释了高胆固醇与肺腺癌不良预后关联的不确定性的原因。因此,进一步阐明胆固醇在肺腺癌增殖和转移中的作用是有必要的。27-羟基胆固醇（27-HC）是最常见的循环氧化胆固醇。已有文献证实,27-羟基胆固醇与高胆固醇血症与乳腺癌增殖转移相关。之前有研究证实27-羟基胆固醇在肺腺癌微环境中促进破骨细胞形成,但目前尚不清楚27-羟基胆固醇是否参与肺腺癌转移,27-羟基胆固醇是否是高胆固醇和肺腺癌转移的关联因素尚不清楚。[方法及结果]1、27-羟基胆固醇促进肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭（1）CCK8实验结果显示,27-HC呈剂量依赖性地促进肺腺癌细胞的增殖。（2）划痕实验结果显示,1μM的27-HC加速了肺腺癌细胞迁移,尤其是在与THP-1分化的巨噬细胞共培养体系中,1μM的27-HC进一步促进了肺腺癌细胞迁移。（3）lμM的27-HC增强了肺腺癌细胞的侵袭能力,在与THP-1分化的巨噬细胞共培养体系中作用更加明显。2、27-HC对胆固醇诱导的肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭是必需的（1）稳转慢病毒shRNA载体稳定敲低肺腺癌细胞中CYP27A1、CYP7B1的表达。（2）在单培养体系中,胆固醇刺激一定程度促进了肺腺癌细胞增殖,且27-HC明显促进肺腺癌细胞增殖,而CYP27A1敲低显著抑制胆固醇和27-HC的诱导增殖作用;CYP7B1敲低对27-HC诱导增殖作用影响不大,但在120小时促进了胆固醇的诱导作用,在96小时之前作用并不明显,可能是由于单纯敲低CYP7B1抑制了肺腺癌细胞增殖。（3）在共培养体系中,胆固醇和27-HC对肺腺癌细胞增殖的促进作用更加明显,CYP27A1敲低明显抑制了胆固醇和27-HC的诱导作用,CYP7B1敲低明显增强了胆固醇和27-HC的诱导作用。（4）在单培养体系中,胆固醇和27-HC均促进了肺腺癌细胞的迁移和侵袭,共培养体系中作用更加明显。CYP27A1敲低抑制了肺腺癌细胞迁移和侵袭,而CYP7B1敲低加速了肺腺癌细胞迁移和侵袭。3、27-HC是胆固醇刺激FGF-2和IL-6释放所必需的（1）通过Milliplex Map多因子检测试剂盒分析胆固醇和27-HC对细胞因子分泌的影响,结果显示,无论在单培养体系还是共培养体系,胆固醇和27-HC均能促进FGF-2和IL-6的释放,尤其是在共培养体系中此作用更加明显。（2）CYP27A1敲低可明显阻断胆固醇促进FGF-2和IL-6的释放的作用,但并不影响27-HC的作用。（3）CYP7B1敲低明显增强了胆固醇和27-HC的作用。4、27-HC是胆固醇诱导PPIB表达的关键因素（1）通过iTRAQ法分析单培养体系和共培养体系中27-HC对肺腺癌细胞差异基因表达的影响,在上调的基因中,PPIB的表达在单培养和共培养体系中均有所增加。27-HC在单培养体系中一定程度地诱导PPIB表达,在共培养体系中显著增强PPIB表达。（2）在单培养体系中,胆固醇处理未明显改变PPIB的表达但在共培养体系中,胆固醇刺激显著促进PPIB表达;CYP27A1敲低几乎阻断了胆固醇诱导的PPIB的表达;在单培养和共培养体系中,CYP7B1敲低均增强了 27-HC诱导的PPIB表达。（3）在共培养体系中,LXR、pAKT和pNFκB p65表达均明显上调,胆固醇和27-HC作用进一步促进了以上分子的表达。CYP27A1敲低明显减弱了共培养体系胆固醇和27-HC对LXR、pAKT和pNFKB p65表达的影响,相反,CYP7B1敲低增强了共培养体系对上述分子的影响。5、27-HC通过激活NFκB诱导PPIB表达（1）27-HC 刺激肺腺癌细胞诱导 LXR、PPIB、Snail、Vimentin、pAKT 和 pNFκB p65的表达。LXR敲低在一定程度上减少27-HC诱导的Snail和Vimentin的表达,但对PPIB、pAKT、pNFκBp65的表达没有明显影响。（2）FGF2刺激肺腺癌细胞明显促进PPIB和pNFκB p65的表达,一定程度诱导Snail和Vimentin的表达,但对LXR和pAKT的表达没有明显影响。（3）IL-6 刺激肺腺癌细胞促进 pAKT、pNFκB p65、PPIB、Snail 和 Vimentin 的表达,但对LXR的表达没有影响。（4）SN50被用来抑制NFκBp65的激活。结果表明,SN50预处理肺腺癌细胞同时抑制 27-HC 诱导的 LXR、PPIB、pAKT、pNFκB p65、Snail 和Vimentin 的表达。6、高胆固醇饮食促进了体内肺腺癌转移（1）裸鼠尾静脉注射肺癌细胞转移瘤模型活体成像检测显示,与正常饮食相比,高胆固醇饮食明显加速肺腺癌的体内转移,敲低CYP27A1明显抑制了高胆固醇饮食诱导的肺腺癌体内转移;相反,CYP7B1敲低尤其是在高胆固醇饮食的情况下加速了肺腺癌体内转移。（2）HE染色显示,高胆固醇饮食增加了肺组织结节数量和大小,CYP27A1敲低减少了肺组织结节,CYP7B1敲低增加了肺组织结节。（3）高胆固醇饮食促进PPIB的表达,CYP27A1敲低抑制了 PPIB的表达,而CYP7B1敲低增强了 PPIB的表达。（4）收集小鼠血清,LC-MS法检测血清氧化胆固醇水平。结果显示,在CYP7B1敲除组,高胆固醇饮食升高了血清27-HC水平。在对照组和CYP7B1敲低组中,高胆固醇饮食增加了血清4β-羟基胆固醇（4β-HC）和25-羟基胆固醇（25-HC）的水平。高胆固醇饮食降低了对照组和CYP27A1敲低组中血清4-胆甾烯-3-酮水平。7、CYP27A1缺失降低了高胆固醇饮食诱导的肺腺癌体内转移（1）我们构建了 CYP27A1缺陷小鼠（CYP27A1-/-）,经尾静脉注射肺腺癌细胞后,将CYP27A1+/+和CYP27A1-/-小鼠分为两组,分别正常饮食和高胆固醇饮食。结果显示,高胆固醇饮食加速了肺腺癌细胞由尾静脉向肺组织转移,而CYP27A1缺失明显阻断了肺腺癌细胞的体内转移。（2）HE染色结果显示,CYP27A1缺失减少了高胆固醇饮食诱导的肺转移结节数量。（3）免疫组织化学染色结果显示,高胆固醇饮食诱导PPIB、LXR、IL-6和FGF2以及AKT和NFκB p65磷酸化蛋白表达水平升高,而CYP27A1缺失明显抑制了高胆固醇饮食对这些蛋白的诱导作用。（4）血清学分析结果显示,高胆固醇饮食促进了血清27-HC水平,而CYP27A1缺失明显降低了 27-HC水平。[结论]27-HC在高胆固醇诱导的信号转导以及肺腺癌侵袭转移中发挥关键作用。此外,27-HC 刺激 FGF2 和 IL-6 的分泌,激活 NFκB,增加 PPIB、Snail、Vimentin的表达。一方面,27-HC通过激活LXR促进Snail和Vimentin的表达,促进肺腺癌细胞的侵袭和转移;另一方面,27-HC通过激活NFκB,促进FGF2和IL-6的分泌,诱导PPIB、Snail和Vimentin的表达,进一步加速细胞侵袭和转移。[目的]肺癌是世界上发病率最高的肿瘤之一,在全球范围内的癌症病例中约占11.6%左右,而肺癌的死亡率占癌症相关的死亡比例达到18.4%。肺癌的种类大致分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。尽管最近关于肺癌的诊断和治疗取得了较大进展,但非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的5年生存率仍然相对较低。近年来高通量测序数据显示,大多数真核生物基因组存在广泛转录的现象。其中具有编码蛋白活性的基因只占2%左右,其余98%左右均为非编码RNA,其中比例最多且具有重要功能的一类为长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNA）。多项研究发现lncRNA分子参与多种生物学过程。本研究通过分析LINC01089在非小细胞肺癌中的表达、功能及机制,明确了 LINC01089可能是治疗NSCLC以及提高患者生存期的潜在靶点。[方法及结果]1、本研究收集2018年11月至2019年1月在中国医学科学院肿瘤医院胸外科接受治疗的60例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织和癌旁组织,通过RT-qPCR分析发现LINC01089在肿瘤中的表达水平明显低于癌旁组织。GEPIA数据库分析LINC01089在肺腺癌和肺鳞癌样本中的表达水平,LINC01089表达与NSCLC患者预后显著正相关（Hazard Ratio（HR）=0.68,P=0.0067）,LINC01089表达较低的NSCLC患者总生存期较差。RT-qPCR检测LINC01089在NSCLC细胞系及正常细胞系中的表达,LINC01089在NSCLC细胞系（A549、H1299、H460和PC9）中的表达下调。2、LINC01089抑制NSCLC的发生发展（1）构建LINC01089稳定过表达或敲低的细胞株,选择内源性LINC01089表达较高的A549和H1299细胞转染sh-LINC01089敲低其表达,内源性LINC01089表达较低的PC9和H460细胞转染pLV-LINC01089质粒进行过表达,CCK-8检测结果显示,敲低LINC01089表达后细胞的增殖能力明显增强,过表达LINC01089明显抑制细胞增殖能力。（2）克隆形成实验也表明,敲低LINC01089可以显著提高细胞的集落形成效率。（3）小鼠皮下成瘤实验,将稳定过表达LINC01089的PC9细胞注射到裸鼠皮下,过表达LINC01089的肿瘤生长显著降低,将稳定敲低LINC01089的A549细胞注射到裸鼠皮下,结果表明,敲低LINC01089可促进肿瘤发生发展。（4）细胞划痕实验发现,敲低LINC01089的A549细胞的迁移能力明显高于对照组细胞,过表达LINC01089的PC9细胞的迁移能力明显低于对照组细胞。（5）Transwell实验发现,LINC01089基因敲低显著提高了 A549细胞的侵袭能力,而过表达则显著抑制了 PC9细胞的侵袭活性。（6）使用shRNA敲低A549（稳定表达荧光素酶）细胞中的LINC01089,尾静脉注射到裸鼠体内建立肿瘤转移模型。体内成像数据显示,LINC01089基因敲低可诱导肿瘤细胞发生更多的肺部转移。（7）利用流式细胞学检测LINC01089基因敲低或过表达是否影响NSCLC细胞周期或凋亡。结果表明,LINC01089敲低促进了细胞从G1期过渡到S期,LINC01089过表达导致细胞停滞于G2期。敲低LINC01089 48小时后实验组与对照组凋亡细胞比例无明显差异。3、LINC01089结合并调控miR-27a的表达（1）利用核质分离实验检测LINC01089在NSCLC细胞中的亚细胞定位,结果显示LINC01089主要定位于细胞质,这说明它可能作为ceRNA发挥功能。（2）StarBase V3.0对LINC01089的潜在靶标进行预测,发现LINC01089中含有与miR-27a结合的互补序列。（3）为验证miR-27a和LINC01089在内源性水平上的直接结合,首先在转染miR-NC或miR-27a的A549细胞系中使用Ago2抗体进行了 RIP实验,结果显示,在miR-27a过表达细胞中,Ago2抗体可以显著富集LINC01089。其次,通过生物素标记体外转录的miR-27a,与细胞裂解液共同孵育,检测细胞中的LINC01089是否与之结合,结果发现生物素标记的miR-27a可以显著富集细胞中的LINC01089。（4）为了进一步确定LINC01089是否直接与miR-27a结合,在过表达miR-27a的PC9细胞中转染含有目的结合序列的LINC01089-wt或含有突变结合序列的LINC01089-mut质粒,进行了双荧光素酶报告基因检测,结果显示转染LINC01089-wt组的荧光素酶活性明显低于LINC01089-mut组。（5）通过检测临床样本中LINC01089与miR-27a的表达值,对其进行相关性分析,结果显示LINC01089与miR-27a表达呈负相关。（6）通过RT-qPCR分析表明,在A549和H1299细胞中敲除LINC01089可促进miR-27a 的 mRNA 表达4、miR-27a 通过 SFRP1-Wnt/β-catenin 通路促进 NSCLC 的 EMT 过程（1）RT-qPCR分析NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织中miR-27a的表达差异,结果显示NSCLC中miR-27a水平明显高于癌旁组织。（2）A549细胞中转染miR-27a抑制剂或miR-27a调控miR-27a的表达,CCK-8实验显示,过表达miR-27a可以显著促进细胞的增殖潜能,敲低miR-27a可以抑制细胞的增殖。Transwell实验表明,miR-27a过表达显著增强了细胞迁移能力,而miR-27a敲低显著抑制了这一现象。（3）NSCLC组织样本中miR-27a的表达与SFRP1的mRNA表达水平呈负相关。（4）A549和H1299细胞中进行细胞挽救实验,过表达miR-27a导致p-GSK-3β和β-catenin表达增加,而敲低miR-27a会引起p-GSK-3β和β-catenin表达降低。沉默SFRP1增强了 p-GSK-3β和β-catenin的表达,而当共同敲低SFRP1和miR-27a后,p-GSK-3β和β-catenin的表达被削弱。（5）RT-qPCR检测EMT标志物表达,结果显示,在过表达miR-27a的细胞中,Slug、Snail和N-cadherin水平显著升高,而SFRP1和E-cadherin表达降低。5、LINC01089 通过 miR-27a-SFRP1-Wnt/β-Catenin 轴抑制 NSCLC 中的 EMT 进程（1）通过细胞挽救实验,敲低LINC01089可以显著促进miR-27a的表达,继续加入miR-27a抑制剂则显著逆转了 LINC01089敲低介导的细胞增殖和迁移。（2）RT-qPCR检测LINC01089的mRNA表达与SFRP1呈显著正相关。（3）敲低 LINC01089 会导致 N-cadherin、、Snail、Slug 和 SFRP1 的 mRNA 水平升高,相应的,Western Blot显示细胞中p-GSK-3β和β-catenin蛋白水平也升高。（4）miR-27a抑制剂在mRNA水平上逆转了 LINC01089敲低引起的EMT相关分子（N-cadherin、E-cadherin、Snail、Slug 和 SFRP1）的表达。miR-27a 抑制剂在蛋白水平上逆转了 LINC01089敲低引起的p-GSK-3β和β-catenin蛋白水平变化。在细胞中过表达LINC01089,结果显示,过表达LINC01089会导致N-cadherin、Snail、Slug和SFRP1的mRNA表达降低,p-GSK-3β和β-catenin蛋白表达也降低。[结论]本研究深入分析了 LINC01089在非小细胞肺癌中的表达、功能及机制。结果表明,LINC01089在非小细胞肺癌组织和细胞中低表达,且与预后密切相关。机制研究发现,LINC01089 通过调控 miR-27a-SFRP1-Wnt/β-catenin-EMT 通路抑制NSCLC的发生发展过程。目前的研究表明,LINC01089可能是治疗NSCLC的一个潜在靶点。