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目的:通过采用氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)分别诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和巨噬细胞(THP-M)建立HUVECs炎性损伤模型和巨噬泡沫细胞模型,探讨ox-LDL对模型细胞自噬影响。观察硫化氢供体药物对细胞自噬水平的影响,揭示抗动脉粥样硬化新机制。方法:(1)HUVECs炎性损伤模型构建以及自噬研究:采用不同浓度ox-LDL(0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL)刺激 HUVECs24h,CCK-8 试剂盒(Cell Counting kit-8,CCK-8)检测 ox-LDL对细胞活力影响;酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测细胞炎性因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α);油红O染色检测细胞红染脂滴多少;蛋白质印记方法(Western Blot,WB)检测细胞自噬体标志蛋白(LC3 Ⅱ)及自噬降解底物蛋白(p62)表达情况;自噬体与溶酶体融合抑制剂巴弗洛霉素(bafilomycin A1,Baf-Al)探究自噬流阻滞情况。(2)人急性白血病单核细胞(THP-1)源性泡沫细胞模型构建以及自噬研究:采用100ng/mL的佛波酯(PMA)处理THP-1细胞48h,诱导为巨噬细胞(THP-M),采用不同浓度 ox-LDL(0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL)刺激THP-M24h,CCK-8法检测ox-LDL对细胞活力影响;胆固醇酯酶法检测总胆固醇(total cholesterol,TC)及游离胆固醇(free cholesterol,Fch),分析细胞泡沫化程度;油红O染色检测细胞红染脂滴多少;WB检测细胞LC3 Ⅱ、p62蛋白表达情况;Baf-A1探究自噬情况。(3)硫化氢缓释供体(morpholin-4-ium4methoxypheny phosphinodithioate,GYY4137)单纯处理HUVECs,检测细胞活性和自噬情况;GYY4137对模型细胞自噬研究:不同浓度 GYY4137(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L)分别预处理HUVECs和THP-M30min,使用相应浓度的ox-LDL共孵育24h,WB检测细胞LC3Ⅱ、p62蛋白表达情况;硫化氢供体药物对模型细胞自噬以及抗炎研究:分别使用相同浓度GYY4137(100μmol/L)、硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)(100μmol/L)预处理细胞30min再与ox-LDL共孵育24h,同时设置Baf-A1以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)作为对照组,WB检测细胞LC3Ⅱ、p62蛋白表达情况,ELISA检测细胞炎性因子。结果:(1)CCK-8结果显示,ox-LDL对细胞活性呈现先增加后减少的趋势,对于HUVECs,ox-LDL浓度为160μg/mL时细胞活性明显下降(*p<0.05);对于THP-M,ox-LDL浓度为200μg/mL时细胞活性明显下降(*p<0.05),同时 GYY4137 在所选浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L)对细胞活性没有影响(ns=差异没有统计学意义)。(2)HUVECs炎性损伤模型:ELISA结果显示,ox-LDL浓度依赖性升高HUVECsIL-6、TNF-α(80μg/mL 和 120μg/mL 差异明显,有统计学意义),油红O染色发现随着ox-LDL浓度增加,红染脂滴增多。提示ox-LDL浓度为120μg/mL造成了 HUVECs炎性损伤。WB结果显示,ox-LDL能剂量依赖性增加HUVECsLC3Ⅱ和p62蛋白表达,加入Baf-AI未能增加LC3Ⅱ蛋白表达(ns),增加了 p62蛋白表达。(3)巨噬泡沫细胞模型:胆固醇酯酶法检测结果显示,ox-LDL剂量依赖性增加TC及Fch,当ox-LDL浓度为 160μg/mL 时,CE/TC=55.74±2.49%>50%(**p<0.01),符合泡沫学规定,同时油红O染色发现当ox-LDL浓度为160μg/mL时,细胞红染脂滴明显,部分细胞破裂,有脂滴溢出。提示ox-LDL浓度为160μg/mL形成了泡沫细胞。WB结果显示,ox-LDL对THP-MLC3Ⅱ蛋白表达呈剂量依赖性增加,p62蛋白表达呈现先减少后增加的趋势且有统计学意义,加入Baf-A1增加LC3Ⅱ表达(#p<0.05),未增加p62蛋白表达。(4)GYY4137在(0-400μmol/L)浓度范围内不能引起HUVECs自噬相关蛋白LC3Ⅱ和p62变化(ns)。(5)不同硫化氢供体(GYY4137、NaHS)100μmol/L可以减少HUVECs炎性损伤模型和巨噬泡沫细胞模型LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值,降低p62蛋白表达(*p<0.05,**p<0.01),减少炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β释放(*p<0.05,**p<0.01);同时发现Baf-A1显著增加HUVECs炎性损伤模型IL-6、TNF-α释放(**p<0.01),3-MA不能明显减少巨噬泡沫细胞TNF-α、IL-1β 释放(**p<0.01)。结论:GYY4137、NaHS对ox-LDL诱导的脐静脉内皮细胞炎性损伤模型和巨噬泡沫细胞模型具有保护作用,且这种保护作用与调节自噬水平有关。