间尼索地平(m-nisoldipine)是河北医科大学药学院自主研发的国家一类新药,存在一对光学异构体(R,S-m-nisoldipine),是新的1,4-二氢吡啶类血管扩张性钙通道受体拮抗剂,适用于心绞痛和高血压的治疗,目前处于临床前研究。本实验旨在建立用胶束电动毛细管电泳法测定间尼索地平及其有关物质的含量,建立环糊精电动毛细管电泳法手性分离间尼索地平对映体的方法,为间尼索地平的质量控制提供新的手段。利用微生物转化法进一步研究间尼索地平的代谢,发现并确定代谢产物结构,总结间尼索地平及其代谢产物的质谱裂解规律,最后采用高效液相质谱联用技术(HPLC-MS)分析测定大鼠体内的间尼索地平和代谢产物,阐明间尼索地平的代谢规律,为评估母体药物和代谢产物的药理学和毒理学性质、理解不同药物在代谢过程中发生相互作用和产生的毒副作用、进一步改造药物的化学结构提供依据和研究思路。第一部分胶束电动毛细管电泳法测定间尼索地平原料药的含量目的:建立间尼索地平的胶束电动毛细管电泳测定方法。方法:以未涂层融硅石英毛细管(60 cm×75μm,有效长度50 cm)为分离柱,10 mmol/L磷酸二氢钠-5 mmol/L硼砂缓冲溶液+ 30 mmol/L十二烷基硫酸钠(pH 8.1)为电泳介质,在分离电压为30 kV,紫外检测波长为214 nm的条件下对间尼索地平进行测定。结果:建立了间尼索地平的胶束电动毛细管电泳测定方法,间尼索地平在30～120 mg/L的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为r=0.9990,检测限为0.9 mg/L。结论:该方法简便、快速、分析成本低,同样适合用于间尼索地平的含量测定,更适用于药物在生产与贮藏过程中的质量控制及杂质检查。第二部分环糊精电动毛细管电泳法手性分离间尼索地平对映体目的:建立分别用SBE-β-CD和CM-β-CD手性拆分间尼索地平对映体的方法。方法:分别用SBE-β-CD和CM-β-CD手性拆分间尼索地平对映体,详细考察手性选择剂、pH、缓冲溶液的种类和浓度、有机改性剂和温度对分离试验的影响。通过与尼索地平和尼莫地平比较,探讨可能的手性识别机制。结果:建立了分别用SBE-β-CD和CM-β-CD手性分离间尼索地平对映体的方法,结果表明SBE-β-CD更适合于其对映体的拆分,而且SBE-β-CD的取代度为7.0的分离效果比4.0的好。证实了二氢吡啶环才可能是地平类化合物的主要手性识别位点;4位苯基上的硝基位置的不同分离效果也不同,其邻位上的硝基(如尼索地平)可增加环糊精对其的手性识别能力。结论:环糊精电动毛细管电泳法是手性分离间尼索地平对映体的另一备选手段,为间尼索地平的制剂及体内后续研究工作打下基础。提出的手性识别机制证实了文献报道的论断,为其它二氢吡啶类药物的CD-EKC分离提供理论依据。第三部分胶束电动毛细管电泳法同时测定间尼索地平及其有关物质目的:建立间尼索地平及其有关物质的胶束电动毛细管电泳测定方法。方法:以未涂层融硅石英毛细管(60 cm×75μm,有效长度11 cm)为分离柱,20 mmol/L硼砂+20 mmol/L十二烷基硫酸钠+体积比为15%的乙腈(pH 8.68)为缓冲溶液,在分离电压为25 kV、温度24℃、紫外检测波长为214 nm的条件下对间尼索地平及其有关物质进行分离测定,同时考察影响分离效果的因素,并用该法研究间尼索地平的加速试验。结果:建立了胶束电动毛细管电泳法同时测定间尼索地平及其有关物质的方法,6种物质在9 min全部实现基线分离。试验中,十二烷基硫酸钠及乙腈的浓度对分离效果影响较大。在考察间尼索地平的加速试验中发现其对光较稳定,但易被氧化成另一未知化合物。结论:该方法快速、分析成本低,为间尼索地平的质量控制提供了新的方法,同时也为地平类其他化合物的毛细管电泳分离测定提供参考。第四部分HPLC-PDA微生物转化法研究间尼索地平的代谢物目的:建立微生物转化研究间尼索地平代谢产物的方法,确定代谢物的结构及转化途径。方法:通过比较14种加药菌液样品和相对应的菌空白、药物空白的HPLC-PDA图谱,发现代谢物并进行放大制备。结果:经1H-NMR、13C-NMR及ESI-MS2确定了间尼索地平2个代谢产物的结构,并推断出间尼索地平的微生物转化途径。结论:微生物转化可模拟间尼索地平的体内代谢,是研究药物代谢的一种切实可行的方法。第五部分HPLC-MS法测定大鼠血浆中间尼索地平及其3个主要代谢物目的:建立间尼索地平及其3个主要代谢物的LC–MS–MS测定方法,研究代谢物的体内变化趋势。方法:6只SD大鼠,按大鼠体重以9 mg/kg的给药量灌胃给予间尼索地平。分别在15,30,60,90,120,180,300,480,720,1440 min不同时间点取血,置于肝素化离心塑料管中,离心取血浆,经过液液萃取后,进样10μl进行LC-MS-MS分析。血浆样品的分析测定采用Symmetry RP-C18分析色谱柱(150 mm×4.6 mm i.d., 5μm),在室温条件下,以乙腈:水(72: 28, v/v)为流动相,流速为0.8 ml/min。扫描方式采用多重反应监测;间尼索地平和代谢物M1采用ESI负离子检测,而代谢物M及M2采用ESI正离子检测。结果:首次建立了间尼索地平及其3个主要代谢物的LC–MS–MS测定方法,方法学验证的数据均在要求的范围之内,并成功应用于大鼠口服给药后间尼索地平及其代谢物的血药浓度测定。实验发现各代谢物的药时曲线趋势与间尼索地平的趋势类似,而且活性代谢物M1的浓度与母药浓度相当,故该代谢物也可能对间尼索地平的药理活性有贡献。在检测代谢物M时所用的离子对m/z 387.3→331.3发现了另一个未知化合物,其分子量与M相同(386),可能为代谢物M的同分异构体,但其详细结构还需进一步研究。结论:本法灵敏度高,适合于间尼索地平及其代谢物的体内含量测定,也为间尼索地平的临床实验研究与新药申报提供了理论依据。