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RecQ解旋酶是DNA解旋酶家族中的一个重要成员,在DNA复制、重组、修复、转录等细胞代谢和维持基因组稳定性等方面具有至关重要的作用。BLM解旋酶是在人体中目前发现的5种RecQ解旋酶之一,BLM解旋酶基因的突变会导致Bloom综合征,患者表现出一系列癌症的高发率,如前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等。许多科学研究证实,肿瘤的发生是由于某些基因表达量的上调或下调,从而导致细胞增殖分化和凋亡失调的结果。本课题组前期研究发现,在许多癌细胞中BLM解旋酶均高表达,该酶的特异性抑制作用可降低癌细胞的增殖,提示可以将BLM解旋酶作为抗癌药物作用的分子靶标来进行相关理论研究。CRISPR/Cas9是第三代基因编辑技术,可对生物体基因组特异位点进行定点改造。目前,CRISPR/Cas9技术已经在许多模式动物的基因敲除方面取得了成功,其方法大部分都是利用注射直接获得模式动物,然而采用CRISPR/Cas9技术敲除人前列腺癌细胞中BLM解旋酶基因,观察BLM解旋酶基因敲除后对细胞增殖的影响还未见报道。因此,本研究以此为出发点,设计4条针对于BLM解旋酶基因位点的gRNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体和Donor载体,并同时转染PC3细胞,通过同源重组的方式将BLM解旋酶基因整体替换掉,再经嘌呤霉素抗性筛选后得到敲除BLM解旋酶基因的细胞,并以敲除BLM基因的细胞为研究对象,经MTT实验、划痕实验、transwell小室实验等方法检测其生物学特性。主要研究结果如下:1.构建CRISPR/Cas9打靶载体设计了4条针对于BLM解旋酶基因位点的gRNA,将它们插入Pcag-T7-cas9+Grna-pgk-Puro-T2A-GFP载体中。测序结果显示目的寡核苷酸双链成功插入质粒中且序列正确,成功构建4个Cas9载体。2.CRISPR/Cas9打靶载体突变效率的检测通过T7E1酶实验检测gRNA敲除活性,电泳图结果显示4条gRNA中gRNA4(AAACACCGAGTCCTTTGTAAGTAGCAAC)出现两条突变条带,故gRNA4-Cas9载体能够在BLM解旋酶基因靶点处引入突变。3.构建Donor载体选用有活性的gRNA4,设计同源臂构建Donor载体。测序结果显示目的寡核苷酸双链成功插入质粒中且序列正确,成功构建Donor载体。4.敲除BLM基因后PC3细胞生物学特性检测经MTT实验、划痕实验、transwell小室实验等检测,发现与野生型细胞相比,敲除BLM解旋酶基因的细胞生长速度显著降低,愈合能力和侵袭能力减弱,但其凋亡能力增加。实验结果说明了BLM解旋酶基因在细胞的生长过程中起到一定的调控作用。