磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP₂）属于细胞膜磷脂类，在细胞膜中含量很低，但对细胞信号转导的调节功能很复杂：PIP₂在磷脂酶C （PLC）的作用下水解生成两个重要的第二信使DAG和IP₃；PIP₂肌醇环的三位发生磷酸化生成PIP₃；PIP₂自身对许多蛋白功能具有调节作用。例如：KCNQ2/Q3钾离子通道具有PIP₂依赖性，PIP₂水平降低通道电流受到抑制，相反PIP₂水平升高通道电流增大，因此KCNQ2/Q3通道电流的大小可以用来指示细胞PIP₂水平的高低。磷脂酰肌醇（PI）主要分布在细胞内质网上，可以通过小泡转运的方式移动到细胞不同的部位。肌醇环上有三个磷酸化位点即三位、四位和五位，不同位点的磷酸化可以生成七种磷酸肌醇。PI4Ks可以使PI四位发生磷酸化生成PI4P，接着在PIP5Ks的催化作用下生成PI（4,5）P₂。而要维持细胞PIP₂水平的动态平衡，还需要有PIP₂的消耗机制。目前我们认为在细胞中最常见的消耗PIP₂的机制有以下几种：PIP₂在磷脂酶C的催化作用下水解生成DAG和IP₃；PI3K催化PIP₂三位发生磷酸化生成PI（3,4,5）P₃；细胞内磷脂酰肌醇-5-磷酸酶使PIP₂发生去磷酸化。这些和PIP₂代谢相关酶活性的改变影响细胞PIP₂水平。细胞膜电位是由于细胞内外离子的不均衡分布和细胞膜对离子的通透性不同而形成的。细胞膜电位也是细胞外电信号刺激传入细胞内的第一步，许多研究表明在细胞膜上存在许多感受膜电位的蛋白，这些蛋白能进一步将电信号传入胞内变成生物信号。本课题研究开始于我们观察到在卵母细胞上细胞膜去极化时，异源性表达的KCNQ2/Q3通道电流表现为持续增大，前期的结果表明细胞膜去极化使PIP₂合成增多导致KCNQ2/Q3电流的增大。因此我们针对细胞膜电位调节PIP₂代谢这一现象，对其分子机制展开研究。首先，对PIP₂再合成途径的研究得知细胞膜去极化增加PKC的活性，进而使PI4K活化增加，促进PIP₂合成增多。其次，初步探索卵母细胞上直接感受膜电位变化的G蛋白偶联受体在膜去极化影响PIP₂代谢中的作用。而后，我们发现高渗透压外液能够阻断细胞膜电位对PIP₂代谢的调节作用。最后，PLC的阻断剂U73122也对细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流有抑制作用，说明PLC水解消耗PIP₂是PIP₂维持在一高水平状态必不可少的。此外，在对PLC阻断剂的研究中发现PLC的另一阻断剂edelfosine对表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流有很强的增大作用。具体研究内容如下：第一部分细胞膜去极化通过PI4K和PKC调节PIP₂的代谢目的：前期实验结果表明在卵母细胞中，细胞膜去极化通过增加PI4Kβ酶的活性，促进细胞膜PIP₂的合成，进而使表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流变大。PKC的激动剂佛波酯（PMA）可以模拟细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流的效果。本部分实验对细胞膜去极化增加PIP₂合成的分子机制进行更深入的研究。研究PKC是否参与了细胞膜去极化升高细胞PIP₂的过程。方法：体外转录的方法制备KCNQ2和KCNQ3通道的cRNA，使用双电极电压钳记录表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流；并观察不同实验条件下电流的变化；薄层色谱的方法检测不同实验条件下卵母细胞PIP和PIP₂含量的变化；RNA干扰技术抑制卵母细胞中PI4Kβ、PKCα或β的表达；Western blot方法检测PI4Kβ水平的变化以及不同PKCs亚型转位到细胞膜的情况；免疫共沉淀验证PKCβ和PI4Kβ相互作用情况；PKC活性测定试剂盒检测PKC活性的变化；细胞免疫荧光化学观察卵母细胞以及心室肌细胞上PI4Kβ和PKCβ的细胞情况。RT-PCR方法鉴定卵母细胞上PI4Ks mRNA情况。结果：（1） RT-PCR和western blot结果显示在卵母细胞中以PI4Kβ亚型为主；（2） PMA增大KCNQ2/Q3电流的特征与去极化类似，增大的倍数为1.98±0.06, n=8；（3）细胞膜去极化和PMA都可以增强PI4Kβ的活性，且采用siRNA技术抑制PI4Kβ的表达能阻断PMA增大电流的作用（PMA，0.65±0.12），薄层色谱的结果显示细胞膜去极化和PMA都能增加卵母细胞PIP和PIP₂的含量（增加的百分比分别为87±33%和48±23%）；（4） PKC细胞外活性测定检验结果显示，与PMA的作用相似，细胞膜去极化使PKC的活性增加（ND96-K孵育，31±3%，n=7；PMA，37±6%，n=7）；（5）免疫印迹结果表明PKCβ亚型在细胞膜去极化刺激下向细胞膜转位。免疫共沉淀结果表明在细胞膜去极化时PKCβ和PI4Kβ结合明显增多；（6） PKCβ特异性抑制剂Enzastaurin （LY317615）能够抑制去极化增大KCNQ2/Q3电流的作用，RNAi实验抑制PKCβ的表达也能阻断细胞膜去极化增大电流的作用；（7）免疫共沉淀结果表明PI4Kβ和PKCβ或PKCα相互作用也存在于大鼠DRG神经元和心室肌细胞中。结论：在爪蟾卵母细胞，细胞膜去极化通过激活PKCβ，进而增强PI4Kβ的活性，最终导致PIP₂合成增加。这一过程不依赖于细胞内外Ca²⁺的存在。本研究揭示了膜电位通过细胞信号通路影响膜磷脂代谢的新机制。第二部分GPCRs在细胞膜电位调节PIP₂代谢过程中的作用目的：研究卵母细胞中G蛋白偶联受体类在细胞膜电位调节磷脂酰肌醇代谢过程中的作用。方法：应用显微注射的实验方法将药物注射进卵母细胞；使用双电极电压钳技术记录表达于卵母细胞的KCNQ2/Q3电流，并观察实验条件下电流的变化情况；通过显微注射将针对Gα不同亚型的反义核苷酸注射入卵母细胞，抑制Gα蛋白的表达；免疫共沉淀技术检测不同实验条件下卵母细胞中Gα和Gβ蛋白偶联情况。结果：（1）显微注射阻断G蛋白的局麻药QX-314（⁴24μM）可以明显抑制细胞膜去极化和PMA增大KCNQ2/Q3电流的作用，增大的倍数由1.75±0.06降低为0.48±0.05。而QX-314对KCNQ通道开放剂RTG和QO-58增大电流的作用没有影响，对通道抑制剂XE991的抑制作用也没有影响；（2）通过灌流给药的局麻药罗派卡因对电流本身的抑制作用与QX-314相似，抑制率为40±5%，但是没有抑制去极化增大KCNQ2/Q3电流；（3）影响Gα蛋白活性的PTX或PMT对细胞膜去极化增大电流的作用没有影响，Gα反义核苷酸对细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流的作用也没有影响；（4）免疫共沉淀实验结果表明Gαs或Gαq和Gβ蛋白偶联在不同实验刺激条件下有明显的不同。结论：G蛋白信号通路可能参与了细胞膜去极化调节PIP₂代谢过程。第三部分渗透压对细胞膜电位调节PIP₂代谢的影响目的：研究高渗透压和低渗透压外液对细胞膜电位调节PIP₂代谢的影响；研究高渗透压外液阻断细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流的分子机制。方法：体外转录的方法制备KCNQ2和KCNQ3通道的cRNA；使用双电极电压钳记录表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流，并观察不同实验条件下电流的变化；western blot检测不同渗透压外液对卵母细胞中PKC向细胞膜转位的影响；应用PKC体外活性测定试剂盒检测渗透压对卵母细胞中PKC活性的影响。结果：（1）低的渗透压外液对表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流没有影响，也没有影响细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流的作用；（2）葡萄糖、蔗糖或甘露醇的高渗透压外液对KCNQ2/Q3电流自身没有明显作用，但是可以阻断细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流的作用。对PMA增大KCNQ2/Q3电流的作用也有抑制作用，并且使PMA增大KCNQ2/Q3电流的作用变为轻微的抑制作用；（3）高渗外液孵育的卵母细胞PKCα和PKCβ两个亚型都向细胞膜转位，PKC活性测定实验结果表明高渗外液孵育使更多的底物发生磷酸化，使PKC的活性增加。结论：细胞膜去极化导致的细胞膜磷脂酰肌醇合成代谢增加、KCNQ2/Q3功能增强的机制可能与高渗细胞外液影响细胞功能的机制类似。第四部分PLC在细胞膜电位调节PIP2代谢过程中作用目的：研究PLC在细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流过程中的作用，并探索PLC所发挥作用的分子机制。方法：体外转录的方法制备KCNQ2和KCNQ3通道的cRNA；使用双电极电压钳记录表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流，并观察不同实验条件下电流的变化；薄层色谱的方法检测不同实验条件下卵膜细胞PIP2含量的变化；RNA干扰技术抑制卵母细胞中PLCγ1或PLCβ3的表达；western blot方法检测不同PLC亚型在卵母细胞上的分布情况以及AKt磷酸化情况；免疫共沉淀的方法验证PLCγ1酪氨酸磷酸化情况以及PLCβ3和Gβ相互作用情况；免疫磷脂沉淀的方法观察PIP3与PLCγ1相结合情况的变化。结果：（1） PLC抑制剂U73122对卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流自身没有影响，但是对细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流有阻断作用，也能阻断PMA增大电流的作用，另一PLC阻断剂Edelfosine对去极化增大电流也有阻断作用，但是其自身对KCNQ2/Q3有很强的增大作用；（2）薄层色谱结果显示U73122能抑制ND96-K升高细胞PIP₂的作用；（3）卵母细胞膜上主要分布的是PLCγ1亚型，免疫共沉淀结果表明去极化的卵母细胞PLCγ1的磷酸化水平明显增高；（4） RNA干扰实验结果表明PLCγ1表达受抑制后，细胞膜去极化增大电流的作用也受到部分的抑制；（5）免疫印迹结果表明细胞膜去极化使Akt磷酸化水平升高，PIP₃与PLCγ1的结合增多。结论：细胞膜去极化升高PIP₂水平，使PIP₂维持在较高水平需要PI3K和PLCγ1的参与。PIP₂水平升高给PI3K提供充足的底物，因此PIP3生成的量也随之增加，进而激活了PLCγ1，保证PIP₂代谢循环的完整性。第五部分Edelfosine增大卵母细胞KCNQ2/Q3电流目的：研究edelfosine对KCNQ2/Q3电流的影响，并对其分子机制进行初步探索研究。方法：体外转录的方法制备KCNQ2、KCNQ3、KCNE1、KCNQ1、Kir2.3、Kir2.1以及KCNQ2（H328C）通道的cRNA；使用双电极电压钳记录表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流，并观察不同实验条件下电流的变化；膜片钳技术记录稳定表达在CHO细胞上的KCNQ2/Q3电流，并观察edelfosine对电流的作用；薄层色谱的方法检测不同实验条件下卵膜细胞PIP₂含量的变化；Western blot方法检测edelfosine对卵膜细胞或CHO细胞上表达的KCNQ2/Q3通道蛋白表达的影响；免疫酶联反应检测Edelfosine对卵母细胞膜胆固醇含量的变化。结果：（1） Edelfosine （ED）对在卵母细胞上表达的KCNQ2/Q3电流有很强的增大作用，增大的倍数为1.35±0.14, n=10，半数有效浓度为1.35±0.51μM，通道抑制剂XE991和LP都能阻断ED增大电流的作用；（2） ED对KCNQ2/Q3电流的I-V曲线和激活特征没有影响，使电流的失活变慢；（3） ED增大KCNQ2（H328C）/Q3电流的强度与对KCNQ2/Q3电流的作用没有明显区别，增大的倍数为1.11±0.44, n=6。但是对内向整流钾离子通道Kir2.1和Kir2.3没有作用。薄层色谱结果显示ED对细胞PIP₂和PIP水平都没有影响；（4） ED增大外源性表达的KCNQ2、KCQ1/E1和KCNQ1电流，也能增大卵母细胞内源性CaCCs（钙激活氯电流）。膜片钳结果表明ED对CHO稳态表达的KCNQ2/Q3电流也有增大作用（0.28±0.08）；（5） Western blot结果表明ED处理的卵母细胞或CHO细胞细胞膜上KCNQ2和KCNQ3通道蛋白表达量没有发生改变；（6）预先孵育β-环糊精能部分抑制ED增大KCNQ2/Q3电流的作用，增大的倍数由1.35±0.14变为0.57±0.14。结论：Edelfosine对表达在细胞膜上的KCNQ2/Q3电流的增大作用依赖于细胞膜脂筏结构的完整性。