论文部分内容阅读
第一部分:卡介苗与灭活卡介苗对白血病患儿外周血树突状细胞体外扩增的影响目的探讨卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)对急性白血病患儿外周血来源树突状细胞(dendritic cell,DC)体外扩增的影响,并对卡介苗与灭活卡介苗(Non-viable Bacillus Calmette-Guerin,NV-BCG)的作用进行比较。方法采用Ficoll-Hypaque法分离急性白血病患者外周血单个核细胞(PBMNC),将本实验分为分为6组①对照组(仅加入RPMI1640完全培养液+1×10~6个单个核细胞);②BCG组(与对照组等量的单个核细胞+BCG 3×10~4cfu);③NV-BCG组(与对照组等量的单个核细胞+NV-BCG 3×10~4cfu);④GTI组(与对照组等量的单个核细胞+rhGM-CSF100 ng/ml、rhTNF-α10 ng/ml、IL-4 50 ng/ml);⑤GTIB组(与对照组等量的单个核细胞+与GTI组等量的细胞因子+BCG 3×10~4Cfu);⑥GTINB组(与对照组等量的单个核细胞+与GTI组等量的细胞因子+NV-BCG 3×10~4cfu)。培养至第9天,对各组细胞进行计数,应用流式细胞仪检测各组细胞免疫表型,并行瑞氏-姬姆萨染液染色,在油镜下观察各组细胞的形态。结果①实验各组均得到一定数量典型的DC,BCG、NV-BCG、GTI、GTIB及GTINB组细胞数分别为(2.58±0.42)×10~5/L、(2.36±0.38)×10~5/L、(3.63±0.37)×10~5/L、(4.15±0.36)×10~5/L及(3.96±0.35)×10~5/L,明显高于对照组(p均＜0.01),BCG与NV-BCG组间无显著性差异,但低于GTI、GTIB及GTINB组(p均＜0.01),而GTI与GTIB、GTINB组比较无显著性差异,GTIB与GTINB组比较亦无显著差异。②BCG组、NV-BCG、GTI、GTIB、GTINB组CD1a+细胞比例分别为24.76±7.51、22.98±7.32、36.12±5.16、38.06±4.20及37.96±4.12,BCG与NV-BCG组间无显著性差异,明显高于对照组(p＜0.05),但低于GTI、GTIB及GTINB组(p均＜0.05),而GTI、GTIB及GTINB组比较无显著性差异;GTIB与GTINB组间亦无显著性差异。BCG、NV-BCG、GTI、GTIB及GTINB组HLA-DR+细胞比例分别为36.73±5.34、35.69±5.11、53.22±1.46、69.29+6.21及65.45±5.98,BCG与NV-BCG组间无显著性差异,明显高于对照组(p＜0.01),但低于GTI、GTIB及GTINB组(p均＜0.01);GTI组低于GTIB、GTINB组(p均＜0.01),GTIB与GTINB组间无显著性差异。BCG、NV-BCG、GTI、GTIB及GTINB组CD83+细胞比例分别为30.22±7.63、29.80±7.51、48.11±8.14、62.83±7.46及60.59±7.50,BCG与NV-BCG组间无显著性差异,明显高于对照组(p＜0.01),但低于GTI、GTIB及GTINB组(p均＜0.05);GTI组低于GTIB、GTINB组(p均＜0.05),GTIB与GTINB组间比较无显著性差异。结论1、BCG能促进树突状细胞的增殖,但其促进树突状细胞增殖的能力弱于细胞因子的联合作用。2、BCG不仅能促进白血病患儿外周血树突状细胞的体外扩增,还能协同细胞因子促进其成熟。3、NV-BCG在促进树突状细胞增殖及树突状细胞成熟方面与BCG无明显差异。第二部分:卡介苗与灭活卡介苗对白血病患儿外周血树突状细胞功能影响的研究目的探讨卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)对急性白血病患儿外周血树突状细胞功能的影响,并对卡介苗与灭活卡介苗(Non-viable Bacillus Calmette-Guerin,NV-BCG)进行比较。方法应用Ficoll-Hypaque法分离急性白血病患者外周血单个核细胞(PBMNC),分为5组:①对照组(GTI组)(1×10~6/mlPBMNC+rhGM-CSF100ng/ml,rhTNF-α10ng/ml,rhIL-4 50ng/ml);②BCG组(与对照组等量PBMNC+BCG3×10~4cfu);③NV-BCG组(与对照组等量PBMNC+NV-BCG3×10~4cfu);④GTIB组(与对照组等量PBMNC+与对照组等量的细胞因子+BCG3×10~4cfu);⑤GTINB组(与对照组等量PBMNC+与对照组等量的细胞因子+NV-BCG 3×10~4cfu)。光学显微镜下每日观察DC的形态,培养9天后收获DC,而后将DC与儿童急性白血病同种异体外周血淋巴细胞混合反应96h后观察淋巴细胞的增殖情况,ELISA方法检测上清中其IL-12、IFN-γ的分泌情况,另将培养9天后的HL-60抗原致敏后的DC与已培养7天的淋巴细胞及HL-60细胞共孵育72h,观察不同组别DC对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性杀伤HL-60细胞活性影响的不同。MTT法检测其杀伤活性。结果①混合淋巴细胞反应(1)T细胞扩增指数:当刺激细胞数为1×10~3时,GTIB与GTINB组T细胞的扩增指数分别为2.56±0.27;2.54±0.25,两组间无显著性差异,但明显高于GTI组、BCG组、NV-BCG组(p均＜0.05),随着刺激细胞数的增加,GTIB与GTINB组T细胞的扩增指数亦明显增加,明显高于相同刺激细胞数的GTI组、BCG组、NV-BCG组,BCG与NV-BCG组间无显著性差异。(2)细胞因子分泌量:当刺激细胞数为1×10~4时,GTIB与GTINB组IL-12分泌量分别为(79,70±13.55)和(77.83±12.51)pg/ml,两组间无显著性差异,但明显高于GTI、BCG及NV-BCG组(p均＜0.05),BCG与NV-BCG组间无显著性差异;GTIB与GTINB组IFN-γ的分泌量分别为(127.47±22.51)和(118.25±20.32)pg/ml,两组间无显著性差异,但明显高于GTI、BCG及NV-BCG组(p均＜0.05),BCG与NV-BCG组间无显著性差异。②杀伤白血病细胞活性:GTIB、GTINB、BCG及NV-BCG组杀伤HL-60细胞活性均较GTI组显著增强(p均＜0.05),以GTIB及GTINB组杀伤HL-60细胞活性最强,而GTIB及GTINB组间无显著性差异,BCG与NV-BCG组间亦无显著性差异。结论1、BCG诱导后的DC能促进T细胞的增殖和分泌,且随着刺激细胞数目的增加,T细胞扩增能力进一步增强;其杀伤白血病细胞活性较GTI组增强。提示BCG能够促进DC的成熟,增强DC抗原提呈能力,从而增强急性白血病患儿外周血来源树突状细胞介导的抗白血病免疫效应。2、BCG联合细胞因子应用后能促进T细胞的增殖和分泌,使T细胞杀伤白血病细胞活性的效果更为明显。3.NV-BCG能诱导DC产生,并促进T细胞的增殖分泌及杀伤HL-60细胞的活性,与BCG无明显差异。4.急性白血病患儿外周血单个核细胞能诱导出DC,在DC作用下T淋巴细胞能产生一定量的IL-12、IFN-γ,并能有效的杀伤白血病细胞。