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前言阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性痴呆为临床表现的神经退行性疾病。随着人口的逐渐老龄化,AD的发病率呈逐年上升趋势,给社会和家庭带来了沉重的负担,由于缺乏有效的治疗手段,AD已成为危害人类健康的主要致死性疾病之一。AD典型病理特征包括:β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）在脑内神经元外病理性沉积形成的老年斑（senile plaques,SP）、神经元内微丝微管高度螺旋化形成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）和神经元的大量丢失。到目前为止,AD的具体发病机制还不是十分清楚,但越来越多的证据表明,神经元凋亡是导致神经元丢失的重要原因,神经元的大量丢失致使AD患者认知功能的进行性下降。现在普遍认为细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶caspase级联反应事件的结果,其中caspase-3被证实处于该级联反应的下游,它通过降解细胞内相应底物使细胞死亡,是凋亡事件的真正执行者。海马结构与学习记忆功能密切相关,且是AD最早和最易受损的部位,因此,海马结构神经元的凋亡直接影响到AD患者的认知功能。目前多数学者认为:Aβ在脑组织中的沉积是各种原因诱发AD的共同通路,也是AD形成和发展的关键因素。现有的研究结果表明:Aβ的异常沉积可以启动细胞内多种蛋白参与的系列级联反应,诱导神经毒性,损伤神经系统,导致患者出现认知功能障碍等。但究竟有哪些蛋白和酶参与了Aβ诱导神经毒性损伤,以及这些蛋白分子之间的相互作用和调控机制如何?目前尚未完全阐明。因此,进一步探讨Aβ致神经元损伤作用具有重要的理论意义和临床价值。PI3-K/Akt信号通路是细胞内重要的促细胞存活途径,PI3-K在生长因子受体等胞外信号活化后,通过磷酸化下游蛋白激酶Akt而使其活化,活化的Akt可以磷酸化凋亡相关基因,使促凋亡基因失活、抗凋亡基因活化,从而起到抑制细胞凋亡及促进细胞存活的作用。那么,Aβ致神经元损伤作用是否与抑制了Akt的活化有关呢?关于这方面的研究国内外报道尚少。多奈哌齐（Donepezil,DN）作为一种选择性的胆碱酯酶抑制剂而用于临床AD的治疗,能明显提高AD患者的学习记忆能力。目前体内外研究发现DN可减少自由基的产生、抑制谷氨酸的兴奋性毒性,但其是否可减少Aβ诱导的神经元凋亡,抑制凋亡相关基因caspase-3的表达,以及此作用是否与Akt的活化有关等研究国内外报道还很少。因此,本研究拟采用体内外研究相结合的方法,分别进行体外Aβ干预大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（Phaeochromocytoma cell,PC12细胞）,体内大鼠侧脑室注射Aβ,同时给予多奈哌齐进行治疗,探讨Aβ对神经元的损伤作用及多奈哌齐对海马结构神经元的保护作用以及它们作用的可能机制。从而进一步研究Aβ的神经毒性,同时为DN的临床应用提供可靠的实验依据,为预防或治疗AD及其药物开发奠定理论基础。材料与方法一、体外研究1、细胞培养:PC12细胞在含10%胎牛血清、5%马血清的RPMI-1640培养基,37℃,5%CO2培养箱中传代培养。2、MTT比色法:选用不同浓度Aβ25-35诱导PC12细胞,24h后检测各浓度细胞的存活率,并选择Aβ25-35的最适浓度建立神经元损伤模型。将细胞分为对照组、模型组,即:未经处理的PC12细胞作为对照组,最适浓度Aβ25-35干预组为模型组。3、流式细胞术:分别检测上述两组PC12细胞的凋亡率。4、细胞免疫组化法:分别检测上述两组PC12细胞caspase-3的表达。二、体内研究1、实验动物及分组:选用中国医科大学实验动物中心提供的雄性Wistar大鼠36只,3月龄,体重250～300g。适应性饲养1w后,将大鼠随机分为3组,即对照组、模型组及治疗组,每组各12只。模型组、治疗组大鼠侧脑室注射Aβ25-3510μl（1μg/μl）,对照组大鼠采用相同方法注射等量0.9%生理盐水。治疗组于侧脑室注射后第3d开始腹腔注射多奈哌齐1.5mg·kg-1·d-1,正常对照组、模型组给予等量生理盐水,持续4w。2、Morris水迷宫行为学测试:测试各组大鼠的近期学习记忆能力,记录其每个时间段的平均逃避潜伏期。3、免疫组织化学染色法:观察各组大鼠海马结构神经元caspase-3阳性细胞的分布和表达情况。4、Western blot方法:分析各组大鼠海马结构T-Akt、P-Akt的表达水平。三、统计学分析结合图像采集分析系统,体内外研究的全部实验数据用均数±标准差（（?）±s）表示,应用SPSS11.5统计软件,用单因素方差分析方法进行组间比较,p＜0.05为有统计学意义,p＜0.01为有显著统计学意义。实验结果一、体外实验结果1、MTT比色法:检测到PC12细胞活性呈Aβ25-35浓度依赖性下降,Aβ25-35的最适作用浓度是20μM。2、流式细胞术:检测到模型组PC12的凋亡率较对照组明显增加。3、免疫组化染色:模型组caspase-3的表达较对照组明显增多（p＜0.01）。二、体内实验结果1、Morris水迷宫测试:模型组大鼠各时间段的平均潜伏期较对照组延长（p＜0.01）,而治疗组各时间段的平均潜伏期较模型组缩短（p＜0.05）。2、免疫组织化学方法:caspase-3阳性反应产物呈棕黄色或棕褐色细颗粒状,主要沉积在海马结构CA1、CA3区的锥体细胞层及齿状回（DG）的颗粒细胞层。对照组大鼠海马结构3个亚区可见少量的caspase-3阳性神经元;模型组阳性神经元较多,阳性反应产物着色较对照组加深,平均光密度值均较对照组明显增高（p＜0.01）;而治疗组caspase-3阳性反应产物的平均光密度值均较模型组减少（p＜0.05）。3、Western blot方法:三组大鼠海马结构的T-Akt的表达量无显著差异（p＞0.05）,模型组P-Akt的表达较对照组降低（p＜0.05）,治疗组P-Akt的表达量相对于模型组呈升高趋势（p＜0.05）。结论1、Aβ25-35诱导神经元凋亡与其促凋亡基因caspase-3的高表达有关。2、Aβ25-35促caspase-3的表达可能与其抑制了Akt的磷酸化水平有关。3、多奈哌齐减少大鼠海马结构神经元caspase-3的表达可能与其上调Akt的磷酸化水平有关。