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固有免疫是机体抗病毒的第一道防线,在机体被病毒感染后通过模式识别相关受体(pattern recognition receptors(PRRs))识别病毒的不同成分从而启动固有免疫系统,在感染发生的几分钟内受体识别这些病原体后激活固有免疫系统,产生前炎症因子抗菌肽和Ⅰ型干扰素。Ⅰ型干扰素会以自分泌和旁分泌的形式与受体结合并激活信号转导通路。信号通路激活后,干扰素诱导基因(ISG)的表达上调。干扰素诱导基因(ISG)是固有免疫抗病毒和抗肿瘤作用的主要效应分子。干扰素是固有抗病毒的免疫的核心效应分子。重组α-干扰素已经被应用到临床的抗病毒治疗。
乙型肝炎病毒(HBV)是一种双链环状DNA病毒,它的复制需经过一个逆转录的过程,并可整合到宿主细胞基因组中,引起非细胞病变性感染。在全球范围内有4亿感染者,对人类健康造成极大的危害,α-干扰素(Interferon alpha,IFN-α)是目前少数临床治疗乙型肝炎有效的药物之一,但对其抗病毒机制尚未完全明了。为阐明这一作用机制,复旦大学熊伟等,应用人cDNA微点阵芯片检测了人肝肿瘤细胞(HepG2细胞)和来源于HepG2细胞并整合有HBV基因组的HepG2.2.15细胞经IFN-α处理6小时前后基因表达谱的差异。结果发现,与HepG2细胞相比,在HBV持续复制的HepG2.2.15细胞中,IFN-α诱导的髓样细胞分化蛋白(MyD88)的基因表达显著降低,提示HBV复制可能抑制MyD88基因的表达。进一步应用核苷类似药物拉米夫定(Lamivudine)和阿德福韦酯(Adefovir)抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制,再用IFN-α处理细胞,发现HepG2.2.15细胞中MyD88基因的表达显著增加,由此确认HBV可抑制IFN-α诱导的MyD88基因的表达,这也提示MyD88蛋白可能在IFN-α诱导的抗HBV效应中发挥重要的作用。目前已知,MyD88蛋白是Toll样受体(除了TLR3之外,其他TLRs均由MyD88蛋白介导信号传递)、白介素-1受体、白介素-18受体介导的信号通路中的关键分子,由它参与构成的信号级联最终引起核因子kappa B(Nuclearfactor-kappa B,NF-kB)依赖性信号通路的活化。
目的：
熊伟等的研究也表明:在HepG2和Huh7中过表达MyD88蛋白可降低HBV的复制水平。并表明过表达MyDS8蛋白可以激活NF-kB,并且MyD88蛋白对HBV的抑制作用依赖于NF-kB的激活。但是MyD88如何激活NF-kB以及NF-kB激活之后通过什么方式来抑制HBV的复制和蛋白表达,至今还不明了。本课题从MyD88蛋白下游的细胞因子的产生方面来探讨MyD88蛋白抑制HBV复制的分子机制。
方法：
因为这一现象首先在HepG2.215细胞内发现,所以在我首先在HepG2.215细胞中确定MyD88的作用,为了解决HepG2.215细胞转染效率低的问题,我们以连接了MyD88全场序列腺病毒为载体感染HepG2.215细胞,以无关的绿色荧光蛋白(Green-Fluorescent Protien,GFP)作为对照,并用免疫荧光的方法保证了感染的效率,48小时后收细胞,用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测上清中的HBsAg和HBeAg的含量,再抽提RNA逆转录,以实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测HBV RNA水平,并用Northern blotting确认结果,抽提乙肝病毒核心颗粒的DNA(HBV Core-particle DNA),用Real-time PCR检测DNA水平,并用Southern blotting确认。结果发现:与GFP相比,感染了带有MyD88序列腺病毒的HepG2.215细胞的上清中的HBsAg和HBeAg的含量以及细胞内RNA的含量以及Core particle DNA的含量全面下降。
结果：
MyD88的过表达可以激活NF-kB依赖的信号通路,而NF-kB的活化又可以启动一序列细胞因子(包括白介素和干扰素)的转录,由此,我们观察了常见的受NF-kB活性调控的细胞因子是否受到MyD88的调节。由此我们转染了MyD88之后观察一些细胞因子的mRNA水平以及上清中分泌的细胞因子的量,结果发现和其他细胞因子相比,IL-8的表达水平很高,由此我们推测MyD88抑制HBV的复制可能与其诱导IL-8的分泌相关。为确认这一结论,我们进一步测试这些分泌到上清中的细胞因子是否在发挥抗病毒作用,我们做了上清转换试验,即将转染了空载和MyD88的细胞培养24-48h后上清转移到转染了HBV的细胞上再培养一段时间,然后再检测HBV的复制指标,结果表明,和转染了MyD88的细胞上清孵育并不能抑制细胞内HBV的复制。
结论：
MyD88上调的细胞因子并不能抑制HBV的复制,但这些细胞因子的具体作用还有待研究。