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人乳头瘤病毒6型( human papillomavirus type 6 , HPV6)是尖锐湿疣的主要病因,该病的发病率近年来持续上升,是仅次于淋病的第二位性病,并且其病情顽固,易复发,治疗困难。HPV主要衣壳蛋白L1结构比较保守,是主要的种属特异性抗原,可诱生中和性抗体,用于预防HPV的感染。另外,HPV6是引发性疣最常见的病原体,如尖锐湿疣和扁平疣。尖锐湿疣是世界各地高发的性传播疾病。有报道表明,在尖锐湿疣组织中HPV检出率为100%,其中6和11型占90%以上,HPV6与尖锐湿疣有确切的病因关系,为疫苗的应用提供了可能。基于上述的原因,我们对HPV6 L1基因进行了密码子优化,利用原核表达载体pGEX4T-1构建了HPV6 mL1的原核表达载体,IPTG诱导后可见80kD左右的蛋白,对目的蛋白进行了鉴定,并利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B介质对目的蛋白进行了纯化。目的:从质粒pBV105-HPV6扩增获得HPV6 L1片段,将HPV6 L1进行密码子优化。构建HPV6 mL1基因的重组原核表达载体pGEX4T-1/HPV6 mL1,实现HPV6 mL1融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)原核细胞中的表达,摸索目的蛋白的表达及优化条件,并实现目的蛋白的鉴定和纯化。方法:用PCR技术对HPV6 L1基因进行扩增和纯化,并将HPV6 L1基因与克隆载体连接,转化入受体菌,实现目的基因的克隆。将L1基因进行测序,并与GenBank中的序列相比较。根据大肠杆菌偏爱密码子表对L1基因的密码子进行优化,合成优化后的序列。用PCR技术对优化后的HPV6 mL1基因进行扩增和纯化,并将HPV6 mL1基因与克隆载体连接,转化入受体菌,实现目的基因克隆。将测序正确的重组克隆质粒pGEM-T/HPV6 mL1和原核表达载体pGEX4T-1分别进行EcoR I和Sal I的双酶切反应,然后将回收得到的目的基因片段与pGEX4T-1载体大片段,进行定向连接,构建成含目的基因HPV6 mL1的重组原核表达载体。将重组质粒pGEX4T-1/HPV6 mL1转化入BL21(DE3)感受态菌,通过IPTG诱导获得表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot等方法鉴定。分别对表达菌株在不同浓度的IPTG(终浓度1、0.5、0.1mmol/L)和不同诱导时间(4、8、12、20小时)及不同温度(37℃、25℃、20℃)下进行表达条件的优化。大量制备目的蛋白,经过洗涤,变性和复性后使用GE Healthcare公司的Glutathione Sepharose 4B介质对目的蛋白进行亲和纯化。结果:采用PCR方法,从质粒pBV105-HPV6扩增获得HPV6 L1片段。采用T/A克隆法,实现了HPV6 L1的克隆,测序结果表明克隆基因序列与GenBank中HPV6 L1基因序列同源性为99.9%,有2个碱基发生了突变,但编码的氨基酸不改变。将HPV6 L1基因序列进行了密码子优化,优化后序列与优化前序列相比,基因序列的同源性为75%,但编码的氨基酸没有发生变化。密码子优化后,用密码子偏性分析软件CodonW分析,CAI(Codon Adaptation Index)从0.205提高到0.611,CBI(Codon Bias Index)从-0.117提高到0.531,FOP(Frequency of Optimumcodons)从0.356提高到0.730。成功构建了HPV6 mL1克隆基因的重组原核表达载体pGEX4T-1/HPV6 mL1,并用IPTG诱导实现了HPV6 mL1融合蛋白在BL21(DE3)原核细胞中的表达。HPV6 mL1融合蛋白主要以包涵体形式表达,包涵体形式最佳表达条件为浓度为1mmol/L IPTG ,温度37℃,诱导4h。经Glutathione Sepharose 4B柱层析纯化得到HPV6 mL1融合蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供基础,是否具有生物活性还有待于进一步研究。