研究背景脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是中枢神经系统的严重创伤,常导致不可逆的感觉及运动功能丧失和大小便失禁,致残率高,对病人的生活造成极大的损害,给患者家庭及社会带来沉重的负担。脊髓损伤的修复一直是神经科学领域中所面临的一项挑战性的任务。中枢神经系统的自我修复能力很差,脊髓损伤后机体经历原发性损伤和继发性损伤的过程,造成不同程度的神经元和胶质细胞的坏死、凋亡,轴突的断裂、脱髓鞘,脊髓损伤后早期的病理变化主要是由于原发性损伤造成的中央出血性坏死,主要为神经细胞、组织的坏死和脊髓的小血管出血,尤其是灰质的许多小静脉有明显出血；随之而来的继发性损伤对脊髓的影响更大,它的机制涉及损伤部位脊髓缺血缺氧性改变、神经组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸(EAA)毒性作用、神经细胞内离子失衡(钙超载)细胞因子及凋亡学说、自由基损伤与脂质过氧化反应、一氧化氮／一氧化氮合酶(NO/NOS)神经毒性作用等,最终形成坏死囊腔、脊髓组织软化或形成胶质瘢痕,这些继发性损伤造成胶质细胞的反应性胶质化,瘢痕对轴突再生形成障碍,引起脊髓永久性功能丧失。因此如何替代原发性损伤造成的神经细胞缺失和改善继发性损伤造成的影响是治疗脊髓损伤的一个重要课题。脊髓损伤的修复包括神经元及轴突的再生、神经元的整合和突触的建立,神经功能的重建,因此治疗SCI要考虑下行的运动和上行的感觉纤维须再生修复,损伤导致的神经细胞死亡,包括运动神经元和中间神经元,须由正常神经细胞替代。传统的药物及物理治疗对脊髓损伤后功能修复效果不佳,而干细胞替代治疗是治疗脊髓损伤的一个新的方向。干细胞可能通过以下机理在SCI修复中发挥作用：(1)神经替代作用重建神经元环路;(2)提供支持的环境促进神经元轴突的再生；(3)分泌的一些营养因子改善脊髓内的微环境,可以促进部分损伤的神经恢复部分功能。细胞移植必须要有以下特点：细胞易获得,体外增殖快,免疫反应弱,可在宿主神经系统中长期存活等。可移植的细胞包括：脑源性神经干细胞(brain derived neural stem cells, BDNSCs),许旺氏细胞(Schwann cells, SCs),嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cells, OECs),胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs),脐血干细胞(umbilical cord blood stromal cells, UCBSCs),骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)等。神经干细胞是多潜能的具有自我更新的干细胞,它能分化成各种神经细胞,如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等,并能自我更新产生新的神经干细胞,可以在神经发育和神经损伤中发挥作用,神经干细胞也可以在分化前的培养过程中无限增殖。人们在实验中发现,骨髓中存在造血干细胞和骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs), BMSCs在一定的诱导条件下也能分化成神经元、神经胶质等神经细胞。BMSCs作为供体细胞具有胚胎干细胞和神经干细胞所无法比拟的优点：可以很容易地从成人体内获得骨髓细胞,并且对成人损害轻微,自体移植克服了使用胎儿组织所带来的伦理和免疫学方面的问题,移植BMSCs已成为SCI治疗修复研究的热点。脊髓损伤后不利的微环境可能对移植入的细胞造成损伤,促使其凋亡,如何更好的改善微环境,使移植的细胞存活更好是当前研究的一个重要方面。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)能参与神经损伤的代偿和保护,减轻神经损伤的程度,具有对神经系统损伤的修复作用。它可以对造血细胞的生长和分化起介导作用,具有刺激骨髓细胞增殖和成熟的生物学功能,是骨髓造血干细胞的动员剂,可动员大量的骨髓基质细胞进入外周血循环,并可刺激骨髓基质细胞增殖和迁移。另外文献报道,G-CSF可以明显增加实验动物脑损伤周围区的nestin蛋白表达,并降低脑缺血和损伤的死亡率,能参与神经损伤的代偿和保护,减轻神经损伤的程度。有学者认为G-CSF除具有造血刺激因子的功能外,还可以诱导内皮细胞的迁移和增殖,增加神经系统损伤后血管的生成,并促进血液中的骨髓基质细胞迁移至损伤部位,分化为神经元和胶质细胞,并释放一些神经营养因子,可能通过抗凋亡、抗炎症、促血管生长及促神经干细胞分化等多种机制促进神经系统损伤的修复。因此我们希望通过体外培养扩增获得大量纯化的骨髓基质细胞,采用谷氨酸体外诱导模拟脊髓损伤后细胞凋亡的环境,并通过观察粒细胞集落刺激因子对谷氨酸处理的骨髓基质细胞存活率的影响,了解粒细胞集落刺激因子对谷氨酸诱导的骨髓基质细胞凋亡的影响。另外建立稳定的大鼠脊髓全横断动物模型,采用骨髓基质细胞移植联合粒细胞集落刺激因子治疗,通过观察动物的运动功能,组织学检查,细胞的凋亡检查来判断联合治疗对脊髓损伤的疗效.研究目的：1.探索不同浓度的谷氨酸和大鼠骨髓基质细胞共培养对细胞存活率的影响；2.探索不同浓度的粒细胞集落刺激因子对谷氨酸和大鼠骨髓基质细胞共培养后细胞存活率的的影响;3.探索骨髓基质细胞移植联合粒细胞集落刺激因子对大鼠脊髓全横断损伤后神经功能恢复的影响。第一部分大鼠骨髓基质细胞的培养鉴定及谷氨酸对其存活率的影响目的：建立大鼠骨髓基质细胞在体外培养和扩增方法,并从细胞形态、标志性蛋白的表达鉴定所获得的细胞;采用不同浓度谷氨酸和骨髓基质细胞共培养,了解谷氨酸对大鼠骨髓基质细胞存活率的影响。方法：无菌条件下取大鼠股骨胫骨,应用密度梯度离心法分离骨髓基质细胞,体外贴壁培养纯化及扩增骨髓基质细胞,相差显微镜下观察骨髓基质细胞的形态学特征,免疫组化法检测骨髓基质细胞表面的CD34、CD44、CD29、CD90蛋白表达,荧光显微镜下观察其结果;采用流式细胞仪检测其表面CD34、CD44、CD29、CD90的表达；实验分组：A组为对照组,为不加谷氨酸的骨髓基质细胞,B、C、D组分别为加入10、30、50mmol/l的谷氨酸和骨髓基质细胞共培养24h,用Hoechst33342做荧光染色,荧光显微镜观察并记录各组高倍镜下50个细胞中正常和异常细胞的数量,计算各组细胞的存活率,采用one-way ANOVA统计各组细胞存活率的差异,方差齐性时用LSD检验,方差不齐时用Dunnett T3检验,P<0.05表示有统计学差异；流式细胞仪采用Annexin-V/PI染色检测各组细胞的存活率和凋亡、坏死率。结果：传代纯化后的骨髓基质细胞贴壁生长,呈梭形,贴壁生长,增殖旺盛,免疫荧光染色显示胞浆CD29、CD44、CD90均匀红染,CD34胞浆不染色,Hoechst33342对染显示胞核成均匀的蓝色荧光；流式细胞仪检测第2-6代BMSCs中表面标志物表达为CD29、CD44、CD90蛋白表达阳性,CD34阴性。不同浓度的谷氨酸和BMSCs共培养24h后,凋亡和坏死的细胞增多,细胞的存活率降低。随着谷氨酸浓度的增高,出现的细胞核的浓染,碎裂,不均匀的数量增多,细胞的存活率下降,凋亡率和坏死率明显提高;A、B、C、D组细胞的存活率分别为99.11±1.5、83.56±5.6、58.76±5.9、28.29±7.9,各组间有统计学差异,方差不齐(F=1731.232, P=0.000), B、C、D组的细胞存活率均低于正常对照组,和A组之间均有统计学差异(P<0.05),B、C、D组之间细胞的存活率也有统计学差异(P<0.05),随着谷氨酸浓度的增加,细胞的存活率随之降低。流式细胞仪检测不同浓度谷氨酸和BMSCs共培养24h后,细胞的Annexin-V/PI荧光染色显示,在A组中,亦可见到少量的坏死和凋亡细胞,正常细胞为88.4%,坏死细胞为4%,凋亡细胞为3.5%；B组中BMSCs正常细胞为42.3%,坏死细胞为40.9%,凋亡细胞为11.6%；C组中BMSCs正常细胞为40.8%,坏死细胞为44%,凋亡细胞为6.8%；D组中BMSCs正常细胞为37.6%,坏死细胞为47.6%,凋亡细胞为6.9%。结论：1.采用密度梯度离心法和贴壁培养法可获得骨髓基质细胞,经传代后细胞贴壁生长,增殖旺盛,纯化程度高;2.大鼠骨髓基质细胞表面标志为CD 29、CD 44、CD90阳性,CD34阴性；3.谷氨酸可以诱导的骨髓基质细胞凋亡,随着谷氨酸浓度的增加,细胞的坏死和凋亡率增加。第二部分粒细胞集落刺激因子对谷氨酸诱导的骨髓基质细胞凋亡的影响目的：采用不同浓度的粒细胞集落刺激因子和骨髓基质细胞共培养,然后用谷氨酸诱导骨髓基质细胞的凋亡,了解粒细胞集落刺激因子对谷氨酸诱导的骨髓基质细胞凋亡的影响。方法：按照第一部分方法获得骨髓基质细胞,体外培养纯化及扩增骨髓基质细胞；实验分组为A、B、C、D四组,分别为正常BMSCs对照组及应用0、10、50ng/ml的G-CSF和骨髓基质细胞共培养6h后加入30mmol/l谷氨酸继续培养24h,各组均用Hoechst33342做荧光染色,荧光显微镜观察并记录高倍镜下50个细胞中正常和异常细胞的数量,计算各组细胞的存活率,采用one-way ANOVA统计各组细胞存活率的差异,方差齐性时用LSD检验,方差不齐时用Dunnett T3检验,P<0.05表示有统计学差异；流式细胞仪采用Annexin-V/PI染色检测各组细胞的存活率和凋亡,坏死率。结果：荧光显微镜下观察,所有加入谷氨酸的BMSCs和对照组的细胞存活率有统计学差异,方差不齐(F=1243.549,P=0.000)；在B、C、D组中, D组比B组和C组的细胞存活率增加,组间有统计学差异(P<0.05),C组比B组的细胞存活率略有增加,但无统计学差异(P>0.05)。流式细胞仪行凋亡细胞的Annexin-V/PI检测发现,A组的BMSCs,亦可见到少量的坏死和凋亡细胞,正常细胞为88.4%,坏死细胞为4%,凋亡细胞为3.5%；B组中BMSCs正常细胞为40.8%,坏死细胞为44%,凋亡细胞为6.8%；C组正常细胞为41.8%,坏死细胞为42.6%,凋亡细胞为7.4%；D组BMSCs正常细胞为57.4%,坏死细胞为31.9%,凋亡细胞为3.9%。结论：体外实验中一定浓度的G-CSF可以减低谷氨酸诱导的BMSCs凋亡和坏死,提高细胞的存活率。第三部分骨髓基质细胞联合粒细胞集落刺激因子治疗大鼠脊髓全横断损伤目的：制作大鼠脊髓全横断损伤模型,移植骨髓基质细胞,并联合应用粒细胞集落刺激因子,观察其对大鼠脊髓全横断损伤后神经功能恢复的影响。方法：按照第一部分方法体外培养纯化及扩增骨髓基质细胞,用Hoechst33342做细胞的标记,分组行BMSCs和G-CSF治疗。取雌性SD大鼠60只,随机分为4组,每组15只。A组(对照组),大鼠行脊髓全横断手术,术后注射生理盐水对照；B组(G-CSF治疗组),大鼠行脊髓全横断手术后给以G-CSF 50ng/kg/d,连用5天后停止;C组(BMSCs治疗组),大鼠行脊髓全横断手术后给以10μl含有3×106个BMSCs损伤部位直接注射；D组(BMSCs+G-CSF治疗组),大鼠行脊髓全横断手术后给以10μl含有3×106 BMSCs损伤部位直接注射,同时给以G-CSF 50ng/kg/d,连用5天后停止。术后每组9只大鼠每周观察其下肢BBB运动功能评分,连续8周,采用重复测量的方差分析检验每周时各组大鼠BBB评分差异;并在2周、4周、8周后每组各3只鼠用于取材做免疫组化,HE染色等观察损伤部位的情况变化,计数2周时各组caspase-3阳性细胞,4周时NSE、GFAP阳性细胞的数量,采用one-way ANOVA检验各组阳性细胞的统计差异,方差齐性时用LSD检验,方差不齐时用Dunnett T3检验,P<0.05表示有统计学差异。结果：1.神经功能评估：实验过程中2周内A组死亡2只,B组死亡1只,C组死亡3只,D组死亡1只,将死亡鼠的数据去除,后分别按组补足实验做同样的大鼠。各组不同时间点的BBB评分采用重复测量方差分析,而每一时间点各组之间的比较采用单因素方差分析。各组间BBB评分存在显著性差异(F=36.471,P=0.000),而各测量时间点也存在显著性差异(F=157.670,P=0.000),两者之间具有交互效应(F=23.888,P=0.000)。手术后3周开始,所有治疗组BBB评分高于对照组,各组间有统计学差异(P<0.05),随着时间的延长,各治疗组的BBB评分均比对照组增加,所有治疗组和对照组相比都有统计差异性(P<0.05),8周时显示所有治疗组BBB评分均高于对照组,其中,D组和任何其他组相比都有差异(P<0.05)。2.组织学改变：术后4周,各组均有GFAP、NSE阳性细胞存在,计数各组高倍镜视野中0.05mm2范围内NSE、GFAP阳性细胞数,所有四组组间NSE、GFAP阳性细胞数比较均有统计学差异。各组间NSE阳性细胞显示方差不齐(F=198.426,P=0.000),各组间GFAP阳性细胞显示方差齐性(F=18.552,P=0.000)；其中D组中NSE阳性细胞最多,和任何其他组相比均有统计学差异(P<0.05),B、C、D组间NSE阳性细胞也有统计学差异(P<0.05)；C组和D组GFAP阳性细胞比A组增多,有统计学差异(P<0.05),D组和任何其他组相比均有统计学差异(P<0.05),A组和B组GFAP阳性细胞比较无统计学差异(P>0.05)。D组中大鼠脊髓损伤部位均有Hoechst33342阳性细胞存在,免疫荧光显示Hoechst33342阳性细胞部分有NSE、GFAP和Neurofilament染色阳性。术后八周,各组大鼠的HE染色显示：各组脊髓损伤部位形态学观察发现对照组脊髓损伤中心有大的明显空洞,细胞排列杂乱,无规律,损伤范围较大,各治疗组脊髓损伤部位的空洞小于对照组,相对于G-CSF, BMSCs组,G-CSF+BMSCs治疗组的HE染色显示损伤中心的空洞最小,且细胞排列相对更整齐,损伤的范围更小。3.凋亡检测：免疫组化显示：术后2周各组切片均有caspase-3阳性细胞存在,各组间caspase-3阳性细胞有统计学差异,方差齐性(F=69.527,P=0.000),B、C、D组的一定范围内的阳性细胞均比A组少,有统计学差异(P<0.05),而B组和C组相比,无明显统计学差异(P>0.05),D组和任何其他组相比,都有统计学差异(P<0.05)。结论：1.粒细胞集落刺激因子可以抑制脊髓全横断大鼠损伤部位的细胞凋亡；2.移植的BMSCs可以在大鼠体内表达神经元样或神经胶质样细胞的特点；3.骨髓基质细胞移植和粒细胞集落刺激因子联合治疗大鼠脊髓全横断损伤比单纯细胞移植可以获得更好的疗效。