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家蚕是由野桑蚕驯化而来的重要的经济昆虫,通过对丝蛋白基因表达调控、丝蛋白组装机制、丝腺生长发育机理的研究,有望在提高蚕丝产量、获得特殊性能蚕丝纤维、拓展丝腺生物反应器应用等方面取得突破。let-7是一个极其保守的microRNA（miRNA）,在不同物种中都以let-7簇（let-7 cluster,let-7C）的形式存在,在时序性发育、肿瘤的发生与发展、细胞多能性维持等方面发挥重要的转录后调控功能,但let-7在家蚕丝腺中的功能目前尚不清楚。本研究利用基因编辑手段,在丝腺的不同部位实现let-7和let-7C敲除,验证了它们对中部丝腺和后部丝腺生长的影响;利用转录组测序探索了let-7调控丝腺生长的分子机理;筛选得到let-7调控丝腺生长的靶基因,并对靶基因功能进行了研究。研究结果如下:1.家蚕丝腺miRNA研究方法探索为研究丝腺中miRNA的功能,我们试用不同方法来改变miRNA在丝腺中的表达量,以找到最适合丝腺miRNA功能研究的方法。首先以丝腺特异性表达的miR-274为研究对象,合成miR-274 mimic和miR-274 antagomir,注射到家蚕五龄幼虫体内,但它们并不能进入丝腺细胞发挥作用;设计、合成miR-274 sponge序列,构建转基因载体,获得miR-274 sponge转基因家蚕个体,发现miR-274 sponge能特异性的下调丝腺中miR-274,效率约20%;扩增miR-274前体序列,构建转基因过表达载体,分别在中部丝腺和后部丝腺过表达miR-274;设计、合成用于miR-274敲除的一对gRNA,构建双gRNA载体,获得双gRNA转基因表达品系,与后部丝腺Cas9表达品系杂交,得到miR-274后部丝腺敲除品系。检测结果表明miR-274所在基因组序列表现出不同形式的碱基缺失,miR-274在后部丝腺表达量下调了54%左右。这些结果表明,miRNA转基因过表达是家蚕丝腺miRNA获得性功能研究首先方法;组织特异性的miRNA敲除比miRNA sponge是更有效的缺失性功能研究方法。2.let-7C miRNAs时空表达及基本功能分析通过qRT-PCR检测let-7C miRNAs（let-7-5p、let-7-3p、miR-100和miR-2795）在家蚕不同发育阶段和五龄第3天不同组织中的表达情况,发现let-7C miRNAs在丝腺中低量表达。在五龄幼虫丝腺生长过程中,let-7C miRNAs在五龄前期低量表达,随着丝腺的生长,表达量逐渐升高;家蚕完成吐丝后,丝腺细胞进入程序性死亡过程,let-7C miRNAs表达量开始下降,这种表达模式暗示let-7C miRNAs可能与丝腺细胞核内复制有关。化学合成let-7C miRNAs模拟物（mimic）和拮抗剂（antagomir）,在家蚕BmE和BmNs细胞系中上调或下调let-7C miRNAs的表达,初步探索了它们在家蚕细胞中的功能。在BmE细胞中,上调let-7-5p对细胞增殖有明显的抑制作用,上调let-7-3p、miR-100和miR-2795不影响细胞增殖;在BmNs细胞中,上调let-7-5p、let-7-3p、miR-100和miR-2795都能抑制细胞增殖,下调则促进细胞增殖。细胞增殖结果表明,let-7C miRNAs在家蚕细胞增殖过程中可能发挥协同调控作用。3.敲除let-7和let-7C促进中部丝腺生长为了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除丝腺中的let-7和let-7C,我们成构建了家蚕个体双gRNA转基因表达品系:let-7-2gRNA和let-7C-2gRNA,将它们分别与中部丝腺Cas9表达品系（MSG-Cas9）进行杂交,通过荧光筛选、敲除位点测序鉴定和表达量检测获得let-7中部丝腺敲除个体△let-7-MSG和let-7C中部丝腺敲除个体△let-7C-MSG。与对照相比,△let-7-MSG中部丝腺后区增粗、变长,表面平滑;△let-7C-MSG中部丝腺中区和后区与对照相比均有增粗,表面呈串珠状。上述结果表明中部丝腺敲除let-7和let-7C均能显著促进五龄期幼虫中部丝腺的生长,但两者之间存在明显的表型差异。△let-7-MSG和△let-7C-MSG在五龄3天开始出现异常表型,五龄前3天是丝腺细胞核内复制增加、细胞体积变大的关键时期。△let-7-MSG和△let-7C-MSG中部丝腺后区DNA总量分别增加170%和120%,为DNA大量合成提供能量的ATP含量也升高了8-10倍,这表明敲除品系丝腺细胞核内复制显著增强。家蚕幼虫完成吐丝之后,预蛹期家蚕丝腺腔中的丝蛋白全部被组装成丝纤维,而△let-7-MSG和△let-7C-MSG中部丝腺后部则残留大量丝蛋白,导致两种突变体家蚕茧重和茧沉率都显著下降,因此△let-7-MSG和△let-7C-MSG突变体家蚕可以作为研究蚕丝纤维组装的新品种使用。4.let-7作为关键负调控因子参与调控后部丝腺生长为了检测let-7和let-7C敲除是否能促进后部丝腺生长并提高家蚕产丝量,将let-7-2gRNA和let-7C-2gRNA品系与后部丝腺Cas9表达品系（PSG-Cas9）杂交;基于胚胎眼色筛选,获得let-7后部丝腺敲除个体△let-7-PSG和let-7C后部丝腺敲除个体△let-7C-PSG。解剖五龄幼虫,观察表型,△let-7-PSG后部丝腺明显增粗、变长,表面平滑;上簇期的后部丝腺自然悬垂长度增加80%,重量增加150%,茧壳重增加12%。△let-7C-PSG后部丝腺明显增粗、变长,表面呈串珠状,无规则卷曲增加;上簇期△let-7C-PSG后部丝腺长度增加60%,重量增加150%,茧壳重增加12%。let-7和let-7C敲除都能促进后部丝腺生长并提高家蚕产丝量,但两者表型有差异,与中部丝腺表型差异类似。对后部丝腺细胞进行phalloidin及DAPI染色,发现△let-7-PSG和△let-7C-PSG后部丝腺细胞变大、核内复制增加,而△let-7C-PSG部分后部丝腺细胞萎缩发育是造成let-7和let-7C敲除表型差异的主要原因。分别构建后部丝腺let-7和miR-1002795的转基因过表达品系:let-7-OE-PSG和miR-1002795-OE-PSG。于G1代五龄期解剖观察,发现let-7过表达强烈抑制后部丝腺的生长,后部丝腺细胞萎缩、排列无序;let-7-OE-PSG后部丝腺DNA总量降低75%,茧壳重量降低50%,表明let-7过表达抑制后部丝腺细胞核内复制并抑制丝素蛋白的合成。而miR-100和miR-2795同时过表达并不影响后部丝腺生长。由此可见,在let-7C中只有let-7才是调控丝腺生长的关键miRNA。由于后部丝腺生长受阻,造成let-7-OE-PSG茧壳变薄、易碎,类似于Nd-s突变体的丝胶茧。经过统计发现let-7-OE-PSG蚕丝中丝素含量与对照相比降低55%,miR-1002795-OE-PSG也降低10%,表明miR-100和miR-2795也参与调控丝素蛋白的合成与分泌,但let-7是丝腺生长的关键负调控因子。5.转录组测序分析let-7调控丝腺生长的分子机制为了揭示let-7调控丝腺生长和功能的分子机制,我们对五龄3天△let-7-MSG中部丝腺和△let-7-PSG后部丝腺共12个样品进行转录组测序分析,在中部丝腺筛选到184个上调表达差异基因和99个下调表达差异基因,在后部丝腺筛选到271个上调表达差异基因和277个下调表达差异基因;在中、后部丝腺同时发生表达变化的基因共有36个。差异基因GO分类分析显示,中部丝腺差异基因主要在氧化还原反应和脂肪酸生物合成途径中富集,后部丝腺差异表达基因在新陈代谢和糖类转运过程中富集。KEGG pathway富集分析表明,中部丝腺差异表达基因在新陈代谢、过氧化物酶脂肪酸代谢和三羧酸循环等多个通路被富集,而后部丝腺差异表达基因只在叶酸“一碳”代谢途径显著富集。中部丝腺和后部丝腺差异表达基因被富集到完全不同的通路中,表明let-7调控中部丝腺和后部丝腺生长的分子机制不同。6.let-7调控丝腺生长的靶基因鉴定提取家蚕转录本的3’UTR,利用RNAhybrid、miRanda和TargetScan对let-7的靶基因进行预测,共有504个潜在靶基因同时被三种软件预测。与△let-7-MSG和△let-7-PSG转录组测序筛选到的455个上调差异表达基因求交集,筛选出22个靶基因,其中10个基因在△let-7-MSG中部丝腺上调表达,12个基因在△let-7-PSG后部丝腺上调表达。利用qRT-PCR检测let-7表型相关靶基因在丝腺生长中的表达模式,筛选出9个与let-7表达呈相反趋势的基因。用3’RACE扩增了其中6个基因的3’UTR,并将它们克隆到psiCHECKTM-2双荧光素酶报告基因载体上,将融合靶基因3’UTR的重组载体与let-7 mimic共转染至HEK-293FT细胞中,检测结果显示,丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase,PC）、蜕皮激素22激酶（ecdysteroid22-kinase,EcK）和卵母细胞锌指蛋白（oocyte zinc finger protein XLCOF6,XLCOF6）三个基因的荧光素酶活性显著降低,表明PC、EcK和XLCOF6基因的3’UTR上具有let-7的靶位点,它们是let-7的直接靶基因。PC和EcK在中部丝腺上调表达,XLCOF6在后部丝腺上调表达。经靶位点突变实验证实,let-7在PC 3’UTR上存在两个靶位点。通过双荧光素酶体外验证实验证明果蝇的PC基因也let-7靶基因。7.PC在丝腺生长中的功能研究PC是糖代谢通路中的重要基因,丙酮酸羧化酶是糖异生途径的限速酶。为了证实PC是let-7调控丝腺生长的靶基因,我们构建了中部丝腺和后部丝腺PC转基因过表达载体,获得了中部丝腺的PC过表达品系PC-OE-MSG。解剖PC-OE-MSG品系的上簇期幼虫丝腺,发现中部丝腺中区长度增加了25%,DNA总量增加了77%。PC过表达促进了中部丝腺生长和中部丝腺细胞核内复制,与let-7敲除后的表型一致,证明PC是let-7调控中部丝腺生长的靶基因。将PC的gRNA转基因品系与中部丝腺和后部丝腺Cas9表达品系分别杂交,筛选得到PC中部丝腺敲除品系△PC-MSG和PC后部丝腺敲除品系△PC-PSG。测序结果表明,在PC mRNA第二个外显子上存在不同形式的碱基缺失,范围从4 bp到64 bp,PC成功被敲除,但PC的敲除并不影响中部丝腺和后部丝腺的生长,这可能与细胞内的补救途径有关。综上所述,本论文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术、miRNA转基因过表达和转录组测序等手段,系统的研究了let-7和let-7C在中部丝腺和后部丝腺中的功能。证明let-7是let-7C中调控丝腺生长的主要miRNA,敲除let-7能促进丝腺的生长并提高家蚕产丝量。PC、EcK和XLCOF6是let-7的直接靶基因,PC是let-7调控中部丝腺生长的靶基因。不同的gRNA转基因表达品系、let-7和let-7C敲除品系、let-7过表达品系等,为研究丝腺生长发育、丝蛋白基因表达和丝纤维组装提供了丰富的家蚕素材。