牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD/MD）,是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的主要存在于牛的一种病毒性传染病。其临床表现主要有:发热,腹泻,黏膜发炎、糜烂、坏死,母牛繁殖障碍,畸胎,免疫抑制等,给养牛业带来巨大影响。BVDV的非结构蛋白NS5B（Nonstructural protein,NS5B）位于BVDV基因组的3’末端,与3’UTR相邻,在不同的表达系统中均具有RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）活性。在病毒复制方面发挥着重要作用。虽然单克隆抗体已用于疾病的诊断与治疗,但因其体积大、稳定性较差等缺点,其临床应用受到一定限制。纳米抗体（Nanobody,Nb）具有体积小、抗原结合性能好、组织穿透力强、稳定性高等卓越性能,已被应用于临床诊断和治疗。本研究利用噬菌体展示技术筛选BVDV NS5B特异性纳米抗体,并初步研究其抗病毒功能,为开发新的抗BVDV策略奠定基础。其主要研究内容和结果如下:1、将NS5B重组蛋白结合弗氏佐剂免疫成年雄性双峰驼,免疫6轮结束后,ELISA检测骆驼血清中NS5B特异性抗体,其效价可以达到1:128,000。分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,反转录cDNA,使用巢式PCR扩增VHH目的基因,将其克隆至pCANTAB 5E载体中并转化TG1感受态细胞,获得了库容量为4.2×10⁸的双峰驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过3轮Panning,共筛选出8株不同的NS5B特异性纳米抗体,其中Nb1、Nb45、Nb100这三株纳米抗体具有较强结合力。2、以pCANTAB 5E-VHH质粒为模板,用引物Nb-F和Nb-R扩增VHH基因,通过Xba I和EcoR I酶切位点将其克隆入pTrip-CMV-puro载体并转化Trans5α感受态细胞,构建pTrip-CMV-Nbs^EGFP-puro真核表达载体。pTrip-CMV-Nbs^EGFP-puro、psPAX2、pMD2.G三质粒共转染293T细胞,包装表达纳米抗体的慢病毒。将包装好的慢病毒转导MDBK细胞,使用嘌呤霉素和有限稀释法,筛选获得了稳定表达纳米抗体的MDBK细胞系。3、通过病毒感染实验初步证明了细胞内表达的纳米抗体Nb1具有抗BVDV感染的功能。在接毒0.05 MOI BVDV的条件下,Nb1可以完全抑制BVDV的复制。进一步研究表明,细胞内表达的纳米抗体Nb1能够与BVDV编码的NS5B蛋白相互作用。综上所述,该研究筛选到了BVDV NS5B蛋白的特异性纳米抗体,并鉴定了一株纳米抗体具有抗BVDV感染的功能,为进行NS5B的结构和功能研究提供了工具,同时也为研发抗BVDV的药物提供了新的靶点。