目的:A族链球菌(GAS)是一类分布广泛的致病菌,能引起多种临床疾病,包括从喉或皮肤的浅表感染到高度侵袭及具有潜在致死的感染,甚至感染后严重的超敏反应肾小球肾炎、风湿性心脏病等。这些疾病都是由链球菌对呼吸道及皮肤的上皮细胞的黏附引起的。GAS可以通过其菌体表面蛋白与人血浆纤连蛋白(Fibronectin)结合,并以此为分子桥梁再与上皮细胞上的相关受体结合,介导细菌进入细胞,从而逃避宿主细胞对它的吞噬和杀伤[1]。Fba蛋白是一种新发现的表达于GAS表面的蛋白,它至少存在于18个血清型中,并具有结合FHL-1、FH和纤连蛋白的能力。研究表明,Fba蛋白有助于GAS的抗吞噬,与FHL-1结合后能促进GAS进入人体上皮细胞,是一种重要的毒力因子[2,3]。鉴于此,本课题选取了Fba蛋白编码基因为研究对象,构建了Fba原核表达质粒和真核表达质粒,之后诱导原核质粒表达,通过Western blot和ELISA检测重组蛋白。并将真核表达质粒和纯化的重组Fba蛋白免疫小鼠,对它们所诱导的体液免疫和细胞免疫进行评估,以进一步对其免疫原性及Fba在抗GAS感染免疫中的作用进行分析,为进一步研制以其为基础的诊断试剂和疫苗提供依据。方法:1 PCR方法扩增Fba基因,克隆至pMD18-T载体上进行测序,测序正确后,经BamHI、EcoR I和BamHI、XhoI双酶切后,将其分别克隆至原核表达质粒pGEX4T-2和真核表达质粒pcDNA3.1。2原核表达质粒通过IPTG诱导,获得了高效表达的蛋白包涵体,采用从SDS凝胶上电洗脱回收的方法进行纯化回收,Western-blot和ELISA鉴定表达的目的蛋白。3以该蛋白作为抗原包被酶联板检测GAS全菌免疫鼠血清,未免疫鼠血清,抗链“O”阳性病人血清及健康志愿者血清中可能存在的Fba抗体,同时以GAS的M蛋白包板检测以上各类血清中的M抗体作为阳性对照。4雌性BALB/c小鼠随机分成6组,分别为Fba蛋白免疫组、M蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba+Fba蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba免疫组、pcDNA3.1空质粒对照组及PBS对照组。ELISA检测各免疫组血清IgG的动态变化水平;脾细胞增殖试验及流式细胞术检测小鼠体内CD4+、CD8+淋巴细胞的变化。给予链球菌攻击评价Fba蛋白及质粒对免疫小鼠的保护功效。结果:1 PCR方法获得了Fba基因,测序正确后,成功构建了原核表达质粒pGEX4T-2/fba和真核表达质粒pcDNA3.1/fba。2在大肠杆菌中成功表达了Fba重组蛋白,表达蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA和Western-blot证实表达的Fba重组蛋白可与已知兔抗Fba阳性血清产生特异性反应。3 Fba蛋白可与GAS全菌免疫鼠血清、抗链“O”阳性病人血清发生特异性结合,尽管Fba蛋白做为诊断抗原的检测结果比M蛋白的检测结果的OD值小,但二者的检测结果一致,均为阳性。4质粒或蛋白免疫后小鼠IgG产生水平以Fba蛋白免疫组增高最为明显,依次为Fba质粒蛋白混合免疫组及Fba质粒组。特异性抗原诱导后体外脾细胞增殖试验显示:pcDNA3.1/fba免疫组增值水平明显高于其它组,流式细胞检测结果与此一致,并显示CD4+、CD8+T细胞水平较对照组有显著性增高。5链球菌攻击后,PBS组小鼠在4天内全部死亡,而Fba蛋白组、pcDNA3.1/fba+Fba蛋白组及M蛋白组在14天的观察期内均有60%的存活率,pcDNA3.1/fba组为40%。结论:1成功构建了原核表达质粒pGEX4T-2/fba和真核表达质粒pcDNA3.1/fba。2在大肠杆菌中高效表达了Fba重组蛋白。3 GAS感染可以诱导人体及动物体产生Fba抗体,即Fba蛋白与M蛋白一样,也具有良好的免疫原性和抗原特异性。因M蛋白及M抗体是人体感染GAS后诱发超敏反应的主要原因,加之其血清型的多样性,使M蛋白作为GAS的候选疫苗受到限制,故可以考虑Fba蛋白作为GAS的候选疫苗及诊断抗原。4 Fba蛋白能有效地诱导机体产生抗体,Fba真核质粒能有效诱导抗体及Th细胞增殖,且Fba蛋白或基因获得了较强的抗GAS感染的能力,以上结果均提示Fba蛋白很有希望成为GAS的候选疫苗。