牙齿萌出是一个复杂且受到严密调控的过程。大量研究表明,牙囊在牙齿萌出中发挥重要的作用,其中一个重要原因就是牙囊中含有一系列牙齿萌出所必需的调控因子,包括巨噬细胞集落刺激因子-1(CSF-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等,它们能够趋化单核细胞进入牙囊并促使其形成破骨细胞,后者吸收牙槽骨形成牙齿萌出通道。Wise等在研究大鼠牙齿萌出过程中发现:破骨细胞的形成在大鼠出生后3d达到一个高峰期,此时牙囊中的一些牙齿萌出调控因子如CSF-1、MCP-1的表达均达到高峰,表明CSF-1、MCP-1在破骨细胞形成这一高峰期发挥重要的作用。但是Wise发现破骨细胞的形成在大鼠出生后10d左右又达到一个高峰,而此时牙囊中CSF-1、MCP-1等的表达均大大降低,因此Wise等推测在第二个高峰期有另外一些因子促进破骨细胞的形成。2003年Wise等研究发现在大鼠出生后10d左右,血管内皮生长因子(VEGF)在牙囊中的表达达到高峰,推测VEGF在破骨细胞形成的第二个高峰期发挥重要作用。他们在随后又进行了一些研究,证实了他们的推测。但是Wise等的研究结果是基于啮齿动物的实验,其结论是否适用于人类的牙齿萌出还不确定,而且目前有关VEGF在牙齿萌出中作用的研究还缺乏系统性。许多问题如体外培养人牙囊细胞能否表达VEGF、VEGF对人牙囊细胞的生物学作用及可能机制、其它牙齿萌出相关分子对人牙囊细胞VEGF表达的影响、调控人牙囊细胞VEGF表达的信号通路、VEGF对人牙囊细胞OPG、RANKL表达的影响等均还不清楚。本课题将在以往研究的基础上,通过体外培养人牙囊细胞,采用细胞生物学和分子生物学有关方法,比较系统地研究人牙囊细胞VEGF表达及可能信号调节机制、VEGF对人牙囊细胞增殖、分化、凋亡的影响及可能机制、VEGF参与牙齿萌出过程中破骨细胞形成和分化的机理等,以探讨VEGF参与牙齿萌出的生物学机制。本课题的结果将有助于阐明牙齿萌出的分子机制,也为临床阻生牙的正畸矫治以及牙胚的组织工程研究等提供理论基础。本课题的研究内容如下:第一部分:体外培养人牙囊细胞VEGF的表达目的:观察体外培养的人牙囊细胞能否表达VEGF。方法:取一名12岁男孩因正畸需要拔除的下颌第三磨牙的牙囊组织,采用组织块和酶消化相结合的方法体外培养人牙囊细胞,观察细胞形态,并选取第4代细胞进行波形丝蛋白和角蛋白免疫细胞化学染色鉴定其细胞来源。然后选取第4代人牙囊细胞,采用免疫细胞化学染色、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附实验(ELISA)三种方法检测VEGF的表达。结果:在体外成功培养出人牙囊细胞,绝大多数细胞呈典型的成纤维样细胞形态,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,证明细胞来源于外胚间充质。人牙囊细胞抗VEGF染色阳性,阳性部位位于胞浆。RT-PCR检测到人牙囊细胞VEGF mRNA的表达。在人牙囊细胞培养上清液中检测到VEGF蛋白。结论:用组织块结合酶消化法在体外成功培养出人牙囊细胞,经鉴定细胞来源于外胚间充质。体外培养的人牙囊细胞能够合成并分泌VEGF。第二部分:VEGF对体外培养人牙囊细胞生物学特性的影响目的:观察VEGF对体外培养人牙囊细胞增殖、分化、凋亡的影响并探讨可能的作用机制。方法:将生长状态良好的第4代人牙囊细胞接种于96孔培养板上,分别与不同浓度的VEGF孵育3d或与100ng/mL VEGF孵育不同时间,检测VEGF对人牙囊细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。将VEGF和MAPK抑制剂不同组合加入到96孔培养板的细胞中,检测MAPK抑制剂对VEGF介导的牙囊细胞增殖的作用。采用流式细胞仪技术观察VEGF对人牙囊细胞凋亡的作用。结果:VEGF在10~300ng/mL范围内能明显提高人牙囊细胞的增殖水平和碱性磷酸酶活性(P<0.01)。VEGF处理组人牙囊细胞的增殖水平在孵育后1、3、5、7d均明显高于对照组(P<0.01),而VEGF处理组人牙囊细胞碱性磷酸酶活性在孵育后3、5、7d明显高于对照组(P<0.01)。MAPK抑制剂能削弱VEGF介导的人牙囊细胞增殖。VEGF处理组人牙囊细胞的凋亡率略低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:VEGF在一定浓度范围内能够促进体外培养人牙囊细胞的增殖,但无明显抑制牙囊细胞凋亡的作用。MAPK信号通路是VEGF促进人牙囊细胞增殖的一条可能途径。VEGF还能促进体外培养人牙囊细胞碱性磷酸酶活性的升高,提示VEGF可能是促使牙囊细胞向成骨细胞/成牙骨质细胞表型分化的一种诱导因子。第三部分:TNF-α、bFGF对体外培养人牙囊细胞VEGF表达的影响目的:研究TNF-α、bFGF对体外培养人牙囊细胞VEGF表达的影响。方法:选取生长状态良好的第4代人牙囊细胞,采用RT-PCR及ELISA分别检测TNF-α(bFGF)对体外培养人牙囊细胞VEGF mRNA表达及上清液中VEGF含量改变的浓度和时间效应。结果:①不同浓度TNF-α作用1h后, TNF-α处理组人牙囊细胞VEGF mRNA表达均较对照组增强(P<0.05),最佳效应浓度为25ng/mL;不同浓度TNF-α作用12h后,除1ng/mL组外,其余各组上清液中VEGF蛋白含量明显高于对照组(P<0.05)。②在时间效应上,25ng/mL TNF-α作用1h后人牙囊细胞VEGF mRNA表达最强,然后随时间延长其表达逐渐下降,但仍强于对照组(P<0.05);细胞培养上清液中VEGF蛋白含量随时间延长逐渐增加,但TNF-α处理组VEGF蛋白含量高于对照组(P<0.05)。③不同浓度bFGF作用6h后, bFGF处理组人牙囊细胞VEGF mRNA表达均较对照组增强(P<0.05),最佳效应浓度为10ng/mL;不同浓度bFGF作用12h后,bFGF处理组上清液中VEGF蛋白含量明显高于对照组(P<0.05)。④在时间效应上,bFGF作用1、3、6、12h后人牙囊细胞VEGF mRNA表达均较对照组显著增强(P<0.01),其中bFGF作用6h后VEGF mRNA表达最强;细胞培养上清液中VEGF蛋白含量随时间延长逐渐增加,但bFGF处理组VEGF蛋白含量高于对照组(P<0.01)。结论:TNF-α、bFGF能够促进体外培养人牙囊细胞合成并分泌VEGF。第四部分:PKC、cAMP/PKA信号通路在调控体外培养人牙囊细胞VEGF表达中的作用目的:探讨PKC、cAMP/PKA信号通路在调控体外培养人牙囊细胞VEGF表达中的作用。方法:选取生长状态良好的第4代人牙囊细胞,采用Real-time PCR分别检测PKC激动剂(PMA)、PKC非特异性抑制剂(G?6983)、PKC-α和γ特异性抑制剂(HBDDE)、PKC-β特异性抑制剂(LY333531)、cAMP/PKA激动剂(dbcAMP)和抑制剂(KT5720)对体外培养人牙囊细胞VEGF mRNA表达的影响。结果:PMA组和PMA+HBDDE组VEGF mRNA的表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而PMA+G?6983组和PMA+LY333531组VEGF mRNA的表达水平与对照组之间无明显差异(P>0.05)。dbcAMP组VEGF mRNA的表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而dbcAMP+KT5720组VEGF mRNA的表达水平与对照组之间无明显差异(P>0.05)。结论:PKC、cAMP/PKA信号通路均参与体外培养人牙囊细胞VEGF表达的调控,其中PKC信号通路中参与调控的亚单位是PKC-β。第五部分:VEGF对体外培养人牙囊细胞OPG、RANKL表达的影响目的:探讨VEGF对体外培养人牙囊细胞OPG、RANKL表达的影响。方法:将生长状态良好的第4代人牙囊细胞与25ng/mL VEGF孵育不同时间后,采用RT-PCR分别检测OPG mRNA、RANKL mRNA表达的变化,采用ELISA检测上清液中OPG蛋白含量变化。结果:人牙囊细胞与VEGF孵育6h后RANKL mRNA表达最强,与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。其余各组RANKL mRNA表达水平较对照组略有升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。人牙囊细胞与VEGF孵育1h后OPG mRNA表达水平开始下降,但与对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。孵育3h后OPG mRNA表达显著降低,与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。以后OPG mRNA表达水平逐渐恢复,与对照组之间无明显差异(P>0.05)。细胞培养上清液中OPG蛋白含量随时间延长逐渐增加,但VEGF处理组OPG蛋白含量低于对照组(P<0.05)。结论:VEGF能够抑制体外培养人牙囊细胞OPG的表达,促进其RANKL的表达,通过RANKL-RANK-OPG轴调节破骨细胞的形成和分化,参与牙齿萌出的调控。