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第一部分FGL-NS/Exendin-4缓释体系的构建、材料性质检测及释放规律研究目的构建FGL-NS/Exendin-4缓释体系并研究其材料特性及释放规律。方法多肽分子RADA16-I、RADA-FGL、Exendin-4合成,并采用高效液相色谱仪及质谱仪分析纯化。CCK-8细胞毒性检测,确定Exendin-4的细胞毒性范围。RADA16-I和RADA-FGL溶液按照1:1比例混合后,PBS触发自组装,构建FGL-NS自组装多肽支架材料;将Exendin-4混合后,PBS触发自组装,构建Exendin-4浓度为200nM的FGL-NS/Exendin-4缓释体系。肉眼观察自组装凝胶材料的外形。原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)检测 FGL-NS 及 FGL-NS/Exendin-4 缓释体系微纳米结构。流变仪(Rheomete)检测FGL-NS及FGL-NS/Exendin-4流变学性能。体外释放实验分别检测 2%FGL-NS/Exendin-4、1%FGL-NS/Exendin-4 及 0.5%FGL-NS/Exendin-4 缓释体系对Exendin-4的释放规律,评估释放后Exendin-4的结构及功能变化。结果 RADA16-I、RADA-FGL、Exendin-4 的相对分子量分别为 1712.78、3458.74 及4584.16 Da,纯度分别为:98.2%、96.1%、98.6%。AFM 检测证实,FGL-NS/Exendin-4缓释体系自组装后能够形成具有纳米网状纤维结构的水凝胶。流变仪检测显示,FGL-NS/Exendin-4为具有粘弹性的水凝胶。体外释放实验结果显示,1%FGL-NS/Exendin-4缓释体系无明显爆释现象,30天累计释放可达79%,释放后Exendin-4的结构无明显改变,仍具有较好的生物活性。结论成功构建FGL-NS/Exendin-4缓释体系,Exendin-4对FGL-NS的自组装过程无明显影响,能够实现对Exendin-4的缓释调控,释放后Exendin-4的结构及生物功能无明显改变。第二部分FGL-NS/Exendin-4缓释体系的生物相容性及神经保护作用研究目的探索FGL-NS/Exendin-4缓释体系和神经细胞的生物相容性,研究其促进轴突生长、保护神经细胞的作用及具体机制。方法制备1%FGL-NS/Exendin-4缓释体系后,CCK-8细胞毒性试剂盒检测材料的生物相容性。提取原代背根神经节细胞,将其接种到1%FGL-NS及1%FGL-NS/Exendin-4缓释体系表面,免疫荧光染色后,观察材料对神经轴突生长的影响,并进行定量分析。体外采用缺血缺氧模型(Oxygen and glucose deprivation,OGD)模拟脊髓损伤后的缺血缺氧环境,验证1%FGL-NS/Exendin-4缓释体系对PC12细胞的保护效果。流式细胞仪检测实验各组细胞凋亡、线粒体膜电位及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的变化。同时,激光共聚焦显微镜观察细胞内线粒体膜电位及活性氧的变化。Western Blot检测细胞内Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、cyto c、cleaved caspase 3、Bax及Bcl-2的表达变化。结果PC12细胞在1%FGL-NS及1%FGL-NS/Exendin-4培养3天后,细胞无明显死亡;背根神经节细胞培养3天后,和FGL-NS相比,FGL-NS/Exendin-4能够显著促进其轴突生长。流式细胞仪检测结果显示,FGL-NS/Exendin-4能够通过抑制PC12细胞内ROS的产生及保护线粒体,显著减少OGD诱导的PC12细胞凋亡;激光共聚焦显微镜观察到FGL-NS/Exendin-4干预后细胞内线粒体膜电位升高,ROS产生减少;Western Blot检测结果显示,FGL-NS/Exendin-4能够抑制cleaved caspase 3及Bax的表达,上调Bcl-2的表达,减少线粒体内的cyto c释放到细胞质内;并且FGL-NS/Exendin-4能够激活PI3K/Akt通路,采用LY294002抑制Akt通路后能够部分抵消FGL-NS/Exendin-4的抗凋亡效应。结论FGL-NS/Exendin-4缓释体系对细胞无明显毒性,具有较好的生物相容性;能够显著促进神经细胞轴突的延长。FGL-NS/Exendin-4缓释体系能够通过激活细胞内PI3K/Akt通路,抑制线粒体途径介导神经细胞凋亡。第三部分FGL-NS/Exendin-4缓释体系修复大鼠脊髓损伤的实验研究目的建立大鼠脊髓损伤钝性损伤模型,FGL-NS/Exendin-4缓释体系植入到大鼠脊髓损伤区域,探讨FGL-NS/Exendin-4缓释体系修复脊髓损伤的效果及作用机制。方法水合氯醛麻醉SD大鼠后,暴露T10节段脊髓;采用Model Ⅱ型脊髓打击仪制作大鼠脊髓损伤模型。本实验分为假手术组、单纯脊髓损伤组和脊髓损伤后1%FGL-NS/Exendin-4干预实验组,损伤后24 h,将12μL等渗葡萄糖溶液(单纯脊髓损伤组)和1%FGL-NS/Exendin-4(FGL-NS/Exendin-4组)植入到大鼠脊髓损伤区域。术后1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w和8w,采用BBB评分评估各组大鼠脊髓损伤后后肢运动功能恢复情况;术后8周取材,HE染色评估脊髓损伤区域空洞形成情况;免疫荧光染色及Western Blot定量分析,脊髓损伤区域GFAP、NF、Iba-1、TNF-a的表达变化,评估脊髓损伤区域轴突再生、胶质瘢痕形成及炎症反应的情况;Western Blot检测脊髓损伤区域凋亡标志性分子cleaved caspase 3及PI3K/Akt通路相关蛋白p-Akt、Akt分子的表达情况。结果成功建立SD大鼠钝性脊髓损伤模型。BBB评分结果显示,脊髓损伤4周后FGL-NS/Exendin-4缓释体系能够促进大鼠后肢运动功能恢复;脊髓损伤8周后,HE染色结果显示,FGL-NS/Exendin-4缓释体系能够显著减少脊髓损伤后空洞的形成;免疫荧光染色显示,FGL-NS/Exendin-4干预后脊髓损伤区域及周围NF阳性神经元显著增加,GFAP染色阳性细胞减少及空洞面积减小;Western Blot定量结果进一步证实,和单纯脊髓损伤组相比,FGL-NS/Exendin-4干预后脊髓损伤区域神经纤维NF的含量增加,胶质细胞标志性蛋白GFAP表达减少。脊髓损伤1周后,免疫荧光染色检测损伤区域的炎症反应,结果显示Iba-1阳性的小胶质细胞细胞数量显著减少;Western Blot定量结果进一步证实FGL-NS/Exendin-4干预后脊髓损伤区域小胶质细胞标志性分子Iba-1的表达下降,炎症因子TNF-a释放减少。脊髓损伤后5天,Western Blot定量分析脊髓损伤局部凋亡相关分子cleaved caspase 3的表达发现,FGL-NS/Exendin-4干预后能够显著降低其表达水平;同时,发现PI3K/Akt通路关键性分子p-Akt的磷酸化水平增加。结论FGL-NS/Exendin-4能够减少脊髓损伤后的炎症反应及空洞形成,抑制神经细胞的凋亡,保护神经组织;促进脊髓损伤区域神经轴突的再生及长入;抑制脊髓损伤区域胶质瘢痕形成;能够促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的恢复。并且进一步证实PI3K/Akt通路可能参与了 FGL-NS/Exendin-4缓释体系的神经保护作用。