目的　　气道黏液高分泌是影响慢性气道炎症性疾病患者病情变化及预后的独立危险因素;而冷空气刺激对此类疾病的急发或急性加重在一定程度上起着“扳机点”的作用。故深入探究冷刺激在促进人气道黏液高分泌形成过程中的调控机制;对于此类疾病的预防及控制有着极为重要的临床意义。冷诱导 RNA 结合蛋白（cold-inducible RNA-binding protein; CIRP）是机体广泛表达;且参与冷应激的重要应激蛋白;具有核质穿梭能力;其在细胞中的表达定位取决于细胞类型及细胞对外界刺激的特定反应;但其具体机制尚未完全阐明。本研究拟从以下三个方面展开研究;以期为冷空气诱导慢性气道炎症性疾病急性发作的预防及控制提供一定的理论依据。　　（1）截至目前;CIRP 在人体肺上皮的表达缺乏组织学证明;故本研究拟从组织学水平明确CIRP在正常人群、COPD患者及永生化人气道上皮细胞16HBE中的表达和定位。　　（2）利用 CIRP 基因敲除小鼠研究 CIRP 蛋白在气道黏液分泌中的作用;并利用细胞模型探讨TLR4/NF-κB在CIRP信号中的作用。　　（3）深入研究冷应激条件下;CIRP 表达上调;且从细胞核转运至细胞浆的信号机制。　　方法　　（1）目标人群和人支气管上皮16HBE细胞株中CIRP的定位及差异表达：收集目标人群肺组织;免疫组织化学分析目标人群支气管上皮中CIRP的分布特点;蛋白免疫印迹（western blot）法和real-time PCR法检测CIRP在两者中的表达差异;激光共聚焦扫描技术检测16HBE细胞株在冷刺激前后CIRP的分布情况;western blot法检测冷刺激前后总CIRP和细胞浆中CIRP的差异性表达。　　（2）体内实验检测CIRP在冷空气促进气道黏液高分泌中的作用：将野生型小鼠和基因敲除（CIRP-/-）鼠分别分为正常对照组和冷刺激组;处理完成后收集肺组织及肺泡灌洗液。免疫组织化学分析法和western blot 法检测每组小鼠肺组织中CIRP的表达情况;ELISA法和real-time PCR 法分别检测各组小鼠肺泡灌洗液中 MUC5AC 蛋白表达及组织匀浆中MUC5AC mRNA表达结果。　　（3）体外研究CIRP在冷诱导黏液高分泌中的作用机制：不同温度和时长处理16HBE细胞;筛选最适刺激温度和时长。培养细胞分为：阴性对照组、冷刺激组、Cold+CIRP siRNA组、Cold+negative siRNA组、Cold+TLR4 中和性抗体组、Cold+SN50 组、Cold+PDTC 组及Cold+DMSO组。Western blot法检测CIRP、TLR4、p-NF-κB p65表达水平;ELISA法及激光共聚焦扫描检测MUC5AC表达情况;real-time PCR法检测CIRP及MUC5AC mRNA的表达。　　（4）冷应激条件下CIRP的出核机制研究：培养细胞分为：阴性对照组、冷刺激组、Cold+TRPM8 siRNA组、Cold+Scrambled siRNA组、Cold+BCTC、Cold+BAPTA-AM组、Cold+Safingol组和Cold+ GSK3βsiRNA组。钙离子成像法检测细胞内[Ca2+]i浓度;western blot法检测TRPM8、t-PKCα、p-PKCα、t-GSK3β、p-GSK3β、总CIRP及细胞浆中CIRP的表达;激光共聚焦扫描检测各组CIRP的定位表达。　　结果　　（1）CIRP在健康人群和COPD患者中均有表达。COPD患者组中CIRP的表达明显高于正常人群组。人支气管上皮 16HBE 细胞株中有 CIRP的表达;定位于细胞核内。冷刺激后细胞中CIRP表达显著增高;且由细胞核运动至细胞浆。　　（2）冷刺激可促进小鼠肺组织MUC5AC蛋白和mRNA的表达;而敲除CIRP的表达;可有效抑制冷空气诱导的MUC5AC高表达。　　（3）CIRP和MUC5AC无论在蛋白还是基因表达水平均呈温度时间依赖性。抑制TLR4和NF-κB的磷酸化;可降低冷空气对MUC5AC的上调作用。转染CIRP siRNA可显著抑制冷空气诱导的 TLR4和 NF-κB的活化及MUC5AC的过表达。　　（4）冷刺激可激活TPRM8/[Ca2+]/PKCα信号链及上调GSK3β磷酸化水平;使用siTRPM8构建TRPM8缺陷细胞株;或运用TRPM8抑制剂BCTC、细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM或PKCα抑制剂Safingol预处理细胞;可显著降低冷应激下GSK3β磷酸化水平及细胞浆内CIRP的表达水平;但不改变细胞内总CIRP蛋白的表达。　　结论　　（1）CIRP在人之气管上皮细胞中有表达;且COPD患者中CIRP的表达明显高于正常人群。　　（2）冷刺激可诱导16HBE细胞CIRP的高表达;并促进其由细胞核向细胞浆移动。　　（3）体内实验表明CIRP可介导冷空气诱导的MUC5AC高表达。　　（4）冷空气可呈温度依赖性和时间依赖性诱导 CIRP 和 MUC5AC 蛋白和基因的高表达。　　（5）CIRP可能通过TLR4/NF-κB信号通路介导冷空气对MUC5AC的上调作用。　　（ 6 ）在冷应激条件下; CIRP 从细胞核运动至细胞浆可能是通过TPRM8/[Ca2+]/PKCα信号链激活GSK3β激酶成功实现的。