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红毛五加(Acanthopanax giraii Harms)作为药用植物已有悠久的历史,具有祛风除湿、活血化淤的功效。现代药理学研究证实,红毛五加皮中含有多糖类、嘌呤类、皂苷类及萜类物质,而苷类主要为刺五加苷类,尤以刺五加苷E、B为多。其药理作用广泛,已证实具有抗心律失常、抗缺氧、抗肿瘤、抗炎、增强机体免疫力、镇痛、抗辐射、抗病毒、保肝等作用。
血栓栓塞性疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病。祖国医学认为血栓属于血淤范畴,中医的血淤与血小板高聚集状态、血液循环障碍及血栓形成有关;而活血化淤则与抑制血小板功能、改善血液循环障碍,防止血栓形成或溶解血栓有着密切的关系。
本实验首次选用具有活血化淤功效的红毛五加醇提物即红毛五加总苷(Total Glucosides of Acanthopanax Giraldii,TGA)进行抗凝作用的初步研究,以期望研制一种天然、安全、适用范围广的新型抗凝药物,指导临床预防及治疗血栓性疾病。
实验分两部分
目的:从红毛五加茎皮中提取TGA并控制其质量方法:
第一部分红毛五加总苷的提取及其质量控制
1.将红毛五加药材粉碎,经乙醇浸泡,减压蒸-T滤液,氯化钠溶解、正丁醇萃取、正丁醇相减压蒸干、真空干燥等步骤得到浸膏样物质。
2.高效液相分析以乙腈-水(19:81)为流动相,以Diamonsil C<,18>柱(5μm4.6mm×250mm)为固定相,检测波长为220 nm,柱温22℃。
3.以刺五加苷E作为质量控制标准,测定不同提取条件所得TGA中刺五加苷E含量,优化提取过程。
结果:
1.经Molish反应和Libatman反应鉴定,确认提取物为总苷。
2.刺五加苷E线性范围为2.0~40.0 μg/ml,平均回收率为100.13﹪,RSD﹪为0.34﹪。
结论:
1.红毛五加总苷提取率为0.17﹪,TGA中刺五加苷E含量为4.67﹪。
2.方法可靠,简单可行,为控制TGA的内在质量提供了科学依据。
第二部分红毛五加总苷抗凝作用的研究
目的:研究TGA对大鼠、小鼠血小板聚集功能、凝血时间,大鼠凝血活性的影响及TGA对小鼠血小板聚集、凝血时间影响的时效关系。
方法:
1.体外作用研究:将不同浓度(终浓度分别为10 mg/L,20 mg/L,100 mg/L)的TGA与SD大鼠全血孵育,加入花生四烯酸、肾上腺素和二磷酸腺苷,观察TGA对血小板聚集的影响。
2.体内作用研究:
2.1.TGA200,100,50 mg/kg·d×7 d灌胃给药后,分别检测由花生四烯酸、肾上腺素和二磷酸腺苷诱导的SD大鼠、昆明种小鼠全血血小板聚集。
2.2.TGA 200,100,50 mg/kg·d×7 d灌胃给药后,检测SD大鼠的凝血活性(凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间和纤维蛋白原含量)。
2.3.TGA 200,100,50 mg/kg·d×7 d灌胃给药后,分别检测SD大鼠及昆明种小鼠的凝血时间。
2.4.TGA 100 mg/kg灌胃给予昆明种小鼠,分别与用药后0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,4,6,8,12 h检测凝血时间及花生四烯酸诱导的全血血小板聚集阻抗值。
结果:
1.TGA 10 mg/L,20 mg/L,100 mg/L对SD大鼠体外分别由AA,肾上腺素,ADP诱导的全血血小板聚集有抑制作用,且随剂量增加,抑制作用逐渐增强。
2.TGA 200,100,50 mg/kg·d ×7d灌胃给药,对SD大鼠和昆明种小鼠分别由AA,肾上腺素,ADP诱导的全血血小板聚集有抑制作用,且随剂量增加,抑制作用逐渐增强。
3.TGA 200,100,50 mg/kg·d×7d灌胃给药,可明显延长SD大鼠凝血酶原时间,活化部分凝血酶时间及凝血酶时间,减少纤维蛋白原含量,且随剂量增加,作用逐渐增强。
4.TGA 200,100,50 mg/kg·d×7d灌胃给药,均明显延长SD大鼠与昆明种小鼠的凝血时间,且随剂量增加,延长作用更加明显。
5.TGA 100 mg/kg灌胃给药后1.5 h小鼠凝血时间明显延长,可维持约2.5h;给药后1h即可对花牛四烯酸诱导的全血血小板聚集出现抑制作用,可维持约11h。
结论:
1.TGA体内外用药均可通过抑制血小板聚集而达到抗凝作用;其抑制作用广谱,对花生四烯酸、肾上腺素、二磷酸腺苷三条诱导途径均有作用。
2.TGA体内用药可明显延长大鼠凝血酶原时间,活化部分凝血酶时间及凝血酶时间,降低纤维蛋白原含量;对内源性和外源性凝血途径具有抑制作用。