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β-甘露聚糖酶能够水解甘露聚糖内部的β-D-1,4-甘露糖苷键,生成不同长度具有还原性末端的低聚甘露糖,广泛应用于医药、饲料、食品、造纸及纺织等工业领域。自然界中甘露聚糖酶在动、植物,微生物体内普遍存在,其中,微生物来源的甘露聚糖酶,因其具有更广泛的作用pH和温度范围,底物更专一等优点,逐渐成为国内外研究的热点。本研究从实验室保存的产甘露聚糖酶微生物中克隆得到了几个基因片段,将其连接在表达质粒pPIC9K上,并转化Pichia pastoris GS115中诱导表达。主要研究内容如下;1、查找NCBI数据库中芽孢杆菌属β-甘露聚糖酶基因序列进行比对分析,根据保守序列设计引物,扩增得到了 3个基因片段,分别命名为Man-JCC1,Man-JCC2和Man-JCC18,将三段基因连接到表达质粒pPIC9K上,并转化Escherichia coli DH5 α扩增测序。利用NCBI在线BLAST工具进行比对,结果显示与数据库中现有β-甘露聚糖酶基因序列的同源性分别为98%,90%和99%。根据在线信号肽分析软件SignalP 5.0确认,Man-JCC2编码蛋白不存在信号肽序列;使用SWISS-MODEL Workspace在线工具进行蛋白质三维结构模拟分析,显示该基因编码蛋白属于糖基水解酶超家族26家族。2、将克隆序列连接分泌性穿梭表达质粒pPIC9K,经E.coli DH5α扩增后,电转化P.pastoris GS115进行异源表达,经利用甲醇连续96 h诱导,发酵液中β-甘露聚糖酶检测结果显示P.pastoris GS115-JCC2在72 h显示具有最高酶活为539.444 U/mL,而P.pastoris GS115-JCC1未检测到β-甘露聚糖酶活力，P.GS115-JCC18表达活力最高为55 U/mL。3、重组β-甘露聚糖酶P.pastoris GS115-JCC2分离纯化后,对其酶学特性进行了初步分析-结果显示重组Man-JCC2蛋白约为47.2 kDa,最适反应温度为40℃,在50℃保温2 h,能保留60%的初始酶活力,在60℃保温2 h,酶活力剩下36.8%。最适反应pH为6.0,在pH3.0-8.0之间保存1h以上,残余酶活力不低于65%。4、根据重组β-甘露聚糖酶P.pastoris GS115-JCC2序列比对和三维结构模型分析,采用无缝克隆基因技术,选择序列不同位点进行突变,最终得到6个突变株。其中P.pastoris GS115-JCC2-G191D的最适pH较未改造前稍有降低,从6.0变成了 5.5;P.pastoris GS115-JCC2-E400D的最适温度较未改造前,从40℃变为37℃。