羊传染性脓疱病是由羊传染性脓疱病毒引起的绵羊、山羊等反刍动物以及人类的一种急性、高度嗜上皮性、接触性传染病。该病在世界养羊业发达的国家和地区广泛流行，危害较大，造成严重的经济损失，目前尚无有效的治疗药物；接种疫苗被认为是控制该病可靠而有效的手段。当前常规弱毒苗和灭活苗存在毒力返强、不安全、免疫保护率不高等缺点，急需开发一种新型的候选疫苗株以便更好的预防该病的发生和流行。羊痘病毒作为载体表达外源基因的有效性已经被大量研究所证实。因此，本研究选取商品化的山羊痘弱毒疫苗作为载体，构建表达羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组山羊痘病毒，并对其遗传稳定性、理化特性和免疫原性进行检测和初步评价，旨在获得能同时预防山羊痘和羊传染性脓疱病的双价基因工程疫苗。为此，本研究主要开展以下研究工作：1.分离鉴定羊传染性脓疱病毒。对新疆地区疑似羊传染性脓疱病的羔羊唇部结痂进行采集，研磨过滤后接种Vero细胞，分离培养病毒，待出现明显细胞病变时，收集细胞进行电镜观察；通过PCR技术扩增羊传染性脓疱病毒B2L基因，进行测序分析。同时对该分离株和Genbank上公布的中国其他省市区的30个分离株的B2L基因序列进行生物信息学分析并构建系统进化树。实验结果显示：羊传染性脓疱病毒接种细胞后出现明显的细胞病变，通过电镜观察到200nm左右的病毒粒子；PCR技术检测出了大小为1137bp的特异性目的片段。该分离株与其他分离株的核苷酸序列同源性为96.0%-99.1%，氨基酸的同源性为88.7%-99.2%；系统进化树分析显示该分离株与NX/YC-2010分离株遗传距离最近。2.构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒并研究其生物学特性。本研究利用同源重组技术构建含有良好免疫原性的ORFV011(B2L)基因的重组山羊痘病毒。采用PCR技术扩增B2L基因，通过分子克隆技术构建重组载体，并利用脂质体法将其转染已接种山羊痘弱毒株病毒的BHK-21细胞，进行同源重组。利用X-gal蓝白斑筛选重组山羊痘病毒rGPV-B2L。应用PCR、间接免疫荧光和Western免疫印迹等方法对重组病毒进行检测与鉴定。通过TCID50对该重组病毒的理化特性进行评价。实验结果显示：本研究成功构建了重组病毒转移载体。通过蓝白斑筛选纯化获得了重组山羊痘病毒rGPV-B2L，并且连续传代20次后重组病毒B2L基因能够在BHK细胞中稳定的复制、转录及表达。理化特性检测显示该重组病毒经55℃30min或紫外照射60min即可被灭活，且对强酸、强碱、有机溶剂等较敏感。3.初步评价重组山羊痘病毒的毒力及免疫效果。为了评价该重组病毒作为候选疫苗的免疫效果，本文采用初免-加强免疫的策略对6-8周龄的雌性小鼠进行皮下注射，通过间接ELISA检测小鼠血清中的特异性抗体水平，通过双夹心ELISA评估其细胞免疫和体液免疫水平，同时通过攻毒实验对该重组病毒的免疫保护力进行评价。结果显示：重组病毒候选疫苗首免后1周，血清中即可检测到B2L特异性抗体；加强免疫后，血清中的抗体水平显著升高，表明该重组病毒可激发较高的体液免疫。对IFN-γ和TNF-α等细胞因子的检测结果显示，该重组病毒也可强烈地激活机体细胞免疫应答。因此，本研究证实该重组病毒候选疫苗能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答。此外，我们通过攻毒实验对重组病毒的保护力进行评价发现，本研究构建的重组病毒候选疫苗能够提供有效地免疫保护作用。该研究结果为今后进行本体动物的免疫试验及临床的初步应用提供理论依据，同时也为ORFV免疫特性的阐明奠定基础。本研究结果表明我们成功分离到羊传染性脓疱病毒，并且获得了可稳定表达羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组山羊痘病毒疫苗候选株，其具有一定的免疫原性，对ORFV具有一定的抵抗能力，为今后制备羊传染性脓疱-羊痘基因工程活载体疫苗奠定基础，使同时预防山羊痘和羊传染性脓疱病成为可能。