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家蚕是一种重要的经济昆虫,在栽桑养蚕的过程中容易受到感染,给蚕丝产业带来影响。先天免疫是昆虫唯一的防护屏障,明确家蚕先天免疫的分子机制是蚕病防治的关键。肽聚糖识别蛋白作为先天免疫中重要的免疫因子,在识别病原物、激活Toll通路和IMD通路、调节昆虫体内免疫应答等反应中起关键性作用。本研究为了明确家蚕肽聚糖识别蛋白Bm PGRP-L4,在家蚕先天免疫反应中的作用,采用分子生物学技术手段对Bm PGRP-L4的功能进行了初步的探究。本研究利用RT-PCR和TA克隆技术克隆Bm PGRP-L4基因完整开放阅读框,并对其基因序列以及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。采用实时定量PCR技术检测Bm PGRP-L4基因的表达谱。将革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌分别喂食和注射感染家蚕5龄第3天幼虫,通过实时定量PCR分析感染后,Bm PGRP-L4基因在不同组织不同时间点相对表达水平的变化。采用RNA干扰技术,向5龄家蚕体内注射双链RNA,通过实时定量PCR分析Bm PGRP-L4基因在不同组织不同时间点相对表达水平被抑制的情况。构建Bm PGRP-L4表达载体,表达Bm PGRP-L4蛋白,优化Bm PGRP-L4蛋白的表达时间,探索Bm PGRP-L4蛋白在细菌组分中的表达情况。本研究克隆获得家蚕Bm PGRP-L4基因开放阅读框915 bp,编码304个氨基酸,含有一个跨膜结构域、一个PGRP功能结构域、一个Amidase-2功能结构域、不含信号肽;Bm PGRP-L4氨基酸序列与Bm PGRP-L2一致性最高,这两个Bm PGRPs与烟草天蛾Ms PGRP-SC2的氨基酸序列亲缘关系最近;且Bm PGRP-L4缺失了五个Zn2+依赖性结合位点的四个残基（Y、H、T、C）,不具有酰胺酶活性。基因表达谱显示,Bm PGRP-L4在不同发育阶段的表皮、脂肪体、中肠中均有表达,在丝腺中表达量极低,且主要在5龄幼虫中肠中高丰度表达。喂食大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后,Bm PGRP-L4基因在中肠和表皮中诱导上调表达效果显著,6 h、12 h、24 h均出现显著上调情况;在脂肪体中,24 h时Bm PGRP-L4基因均出现上调表达;在丝腺中,12 h时Bm PGRP-L4基因均出现上调表达。注射大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后,表皮在注射金黄色葡萄球菌24 h时,Bm PGRP-L4基因的表达量轻微上调;脂肪体在注射大肠杆菌6 h时,Bm PGRP-L4基因的表达量上调;中肠和丝腺在注射大肠杆菌24 h时,Bm PGRP-L4基因相对表达水平出现了上调。RNA干扰结果显示,表皮的RNA干扰效果出现在干扰后48 h;脂肪体无RNA干扰效果;中肠RNA干扰效果最佳,12 h、24 h、48 h三个时间段均出现基因的抑制表达。通过大肠杆菌的原核表达系统,Bm PGRP-L4蛋白可被IPTG诱导表达,且在1 h、2 h、4 h、8 h这四个时间段内,蛋白表达量随着时间的增加而增加,且主要在细胞碎片中表达。综上所述,Bm PGRP-L4基因在不同龄期不同组织中均有表达,细菌喂食和注射感染后能在不同组织不同时间点诱导上调表达,推测Bm PGRP-L4基因可能参与家蚕幼虫识别细菌的免疫反应。RNA干扰后,Bm PGRP-L4基因的表达水平被抑制。Bm PGRP-L4蛋白能在原核系统中被诱导并在细胞碎片中表达。以上结果为进一步研究Bm PGRP-L4受体蛋白在家蚕中参与免疫反应和其他功能奠定了数据基础。