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流行病学调查显示,圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌(HPS)的混合感染极为广泛,特别是PCV2和嗜血杆菌血清4型(HPS4)的混合感染普遍存在于猪场中,这两种病原微生物给世界养猪业带来巨大损失的重要传染病的感染机制却仍知之甚少,给PCV2和HPS4混合感染的防制带来极大的困难。因此本实验以自然分娩的猪只为模型,观察PCV2单独感染、HPS4单独感染及PCV2和HPS4混合感染仔猪后对其致病性的影响,为病毒和细菌混合感染的诊断和防制提供依据。一、PCV2和HPS4人工感染NFCD仔猪临床学指标的测定与分析在本研究中,我们将24头28-30日龄仔猪,随机分配到四组。第1组(n=6)小猪是气管注射HPS4临床分离株MD0322菌株2mL (5.5×108CFU);第2组(n=6)肌肉注射滴鼻各2.5 mL PCV2-WH毒株(107.3TCID50/ml);第3组(n=6)按上述同样的接种方式同时接种PCV2-WH毒株和HPS4临床分离株MD0322菌株；第4组(n=6)注射相同体积的培养基作为空白对照组。各组接种同步进行,感染28天。通过人工感染建立PCV2、HPS4单独感染及PCV2和HPS4混合感染仔猪的病理模型。1.研究显示：PCV2/HPS4混合感染能造成猪只发热和进行性消瘦,较空白组体重减轻44%,并且临床症状明显严重于任一单独感染组。2.通过对PCV2和HPS4单独感染及PCV2/HPS4混合感染的血常规初步分析,结果显示：PCV2感染早期外周血白细胞亚群总数下降,表明感染早期出现免疫抑制。而混合感染组由于细菌感染影响,外周血白细胞总数略有升高,细菌单独感染早期白细胞总数显著升高。HPS4感染早期中性粒细胞总数显著上升,PCV2和HPS4共感染组感染第七天时候中性粒细胞严重下降。共感染在感染早期导致比单感染更为严重的淋巴细胞减少,共感染对淋巴细胞减少具有加重作用,表明PCV2和HPS4共感染组在病毒感染早期可以导致比单感染更为严重的免疫抑制。3.通过对PCV2/HPS4混合感染组和PCV2单独感染组的病毒血症、排毒规律进行检测分析,结果显示,PCV2/HPS4混合感染组的病毒血症持续时间长且产生的PCV2抗体时间为感染后21天,晚于单感染组一周,表明共感染对感染猪的免疫抑制具有加重作用。而PCV2/HPS4混合感染组血清中病毒载量高于PCV2单独感染组,表明HPS4对PCV2在感染猪体内的增殖具有相互促进作用。4.剖检结果显示：PCV2和HPS4混合感染能引起较严重的淋巴结肿大出血、肺部间质增宽和胃部溃疡,并且混合感染较单独感染组症状严重。定量PCR检测显示PCV2主要分布在扁桃体和淋巴结等免疫器官中,且扁桃体中病毒含量最多,扁桃体中PCV2/HPS4混合感染组和PCV2单独感染组PCV2病毒的平均核酸拷贝数分别为每克3.17×1010及每克2.04×1010。说明PCV2/HPS4混合感染能够促进了PCV2在组织和免疫器官中的增殖,从而加重组织病理损伤。二、运用基因芯片对PCV2和HPS4单独感染及共感染后猪的肺泡巨噬细胞(PAMs)基因表达的差异性比较研究本实验应用Affymetrix芯片进行PCV2和HPS4单独感染及共感染后PAMs猪免疫细胞基因表达变化的检测和研究。将人工感染28天的PCV2和HPS4单独感染以及PCV2/HPS4混合感染的猪只剖杀后取肺脏等组织样,灌洗肺脏得到PAMs,抽提总RNA, RNA标记和杂交实验由北京博奥生物有限公司完成。杂交后的信号校正后用SAS软件中的t检验进行分析显著差异表达的基因。应用MAS3.0软件进行了基因本体功能分类及生物学通路分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov)。结果如下：SAS统计结果表明,共有753个基因在感染与对照的PAMs中表现差异表达倍数在2倍以上(p<0.05)。其中PCV2单独感染组有178呈现上调,80个基因呈现下调；PCV2/HPS4共感染组中有195呈现上调,108个基因呈现下调：HPS4单独感染组中有149呈现上调,43个基因呈现下调。对753个差异表达基因进行了基因本体功能分类及生物学通路分析发现差异表达基因中211个基因可以找到功能注释,在分子功能(molecular function)中可划分为93类,pathway分析显示有19个显著上调的差异基因与细胞因子和细胞因子受体间相互作用通路相关,10个显著上调的差异基因与T细胞受体信号通路有关,这些基因多属于免疫应答和炎症相关差异表达的基因。我们筛选到宿主对病原的免疫应答相关差异表达的基因有：T细胞信号通路相关差异表达的基因有TCR-α、TCR-β、CD3E、CD3G、DPPⅣ、LCK;固有免疫相关差异表达的基因有:Ficolin和A3F；补体系统相关差异表达的基因有：C1s、C1qR、CR2、C4bBP、DAF;抗病毒相关差异表达的基因有：ISG20L2、GBP1、MCP2;病原对宿主免疫监控的逃逸即免疫抑制相关差异表达的基因有S1P1、GATA-3、TGF-β。为研究免疫细胞在病毒与细菌共感染后转录水平的基因表达变化提供重要理论依据,对了解猪体对病原微生物的抵御机制具有重要意义,并且为筛选抗病毒制剂从而预防和控制疾病的发生提供新思路。