VP3基因对胃癌细胞SGC7901的作用和蛋白质组的研究

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目的构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3并稳定转染人胃癌细胞SGC-7901,观察EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中的分布和亚细胞定位,探讨凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的机制。应用双向凝胶电泳(2-DE)结合质谱技术研究VP3诱导凋亡的SGC-7901细胞(实验组)与正常培养的SGC-7901细胞(对照组)的差异表达蛋白质。利用蛋白质组学方法探讨VP3对胃癌SGC-7901细胞作用的分子机制。方法用PCR技术扩增出VP3基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-VP3经脂质体介导转染SGC-7901细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察凋亡素在肿瘤细胞中的分布、亚细胞定位。用AO/EB荧光染色法检测其在体外诱导肿瘤细胞凋亡的效应。通过双向凝胶电泳分离VP3处理前后细胞总蛋白,并对IPG胶条(pH3-10,pH4-7)、SDS-PAGE浓度(10%,12%)、电泳时间(6h,7h)进行优化,PDQuest图像分析,MALDI-TOF-MS质谱鉴定, Mascot软件查询SWISS-PORT蛋白质数据库,半定量RT-PCR检测ICEBERGmRNA水平变化,Western blot在蛋白质水平对ICEBERG进行验证。结果经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,稳定转染细胞中EGFP-VP3在肿瘤细胞中得以高表达,转染后逐渐从细胞质迁移至细胞核,最后定位于细胞核内。AO/EB荧光染色观察到大量细胞凋亡。获得分辨率高、重复性好的SGC-7901细胞双向电泳图谱,对照组样本的2-DE图谱检测到862±36个蛋白点,实验组样本检测到648±27个蛋白点,二者主要蛋白点的位置与数量基本一致。图像分析显示有8个蛋白斑点表达有差异,经MALDI-TOF -MS检测,鉴定了6个可能蛋白,VP3处理后ATP5S、ICBR、TPC6A、TALDO、BAF、RDH13 mRNA和蛋白质表达均下调。结论成功构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3,并成功培养出大量表达绿色荧光蛋白和凋亡素的SGC-7901稳定细胞株。EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中具有核定位效应,并诱导肿瘤细胞凋亡。VP3处理前后有多种蛋白质差异表达,这些蛋白质参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种信号通路,提示这些蛋白质可能参与VP3的抗肿瘤作用。
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