前言环境砷污染是一个严重的公共卫生问题,长期经口摄取无机砷化物可造成全身多系统的损伤,包括神经系统、心血管系统以及典型的皮肤损伤。目前,我国的高砷暴露人口达300万,是世界上受砷中毒危害最严重的国家之一。近年来,砷对中枢神经系统的毒性作用引起了人们的广泛关注。儿童是环境砷暴露的易感人群,国内外流行病学调查均发现长期砷暴露可影响儿童的智力发育。动物实验研究也表明,砷具有一定的智力发育毒性。但长期砷暴露对中枢神经系统损伤的机制如何,尚无明确的结论。星形胶质细胞(Astrocyte, AC)是脑组织中数量最多的细胞群体,其功能不仅仅是支持、保护和营养神经元,它还参与突触间隙神经递质的清除与代谢、促进突触形成与维护突触的正常功能。AC还是血脑屏障的结构基础,故在血管和神经元之间形成了一个屏障,将神经元与外界环境隔离。因此,砷中毒时血液中的砷透过毛细血管后应首先进入AC。此外,AC内具有谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase, GS),突触周围的AC突起上表达高亲和力的谷氨酸转运体GLAST(Glutamate/Aspartate transporter)和GLT-1 (Glutamate transporter-1)。因此,AC不仅能快速清除突触间隙的Glu,而且能对摄入的Glu进行代谢转化,形成谷氨酰胺(Glutamine, Gln)。综上所述,AC很可能是血液中无机砷进入脑组织后初始损伤的靶细胞。本研究以体外原代培养Wistar大鼠的AC为试验对象,探讨砷对AC的毒性作用及其机制,为阐明砷对中枢神经系统损伤的机制提供实验参考数据。材料与方法1、星形胶质细胞的分离、培养、纯化与鉴定取出生1-3天Wistar大鼠的仔鼠,消毒后,断头取大脑皮质,剪碎、胰酶消化结合机械吹打使细胞分散,筛网过滤,将细胞悬液接种在玻璃培养瓶中,培养30min后进行差速粘附处理去除成纤维细胞,将未粘附的细胞悬液接种在塑料培养瓶中,培养9-12d。待细胞基本长满单层,进行细胞传代,GFAP免疫组化染色鉴定培养细胞的纯度。2、染毒与分组以亚砷酸钠为染毒物。共分为5组,培养液中含砷浓度分别为0、5、10、20或30μmol／L,培养24h后检测如下指标。3、检测指标与方法(1)MTT法检测细胞活力。(2)倒置显微镜观察细胞形态及生长状态,并采集图像。(3)流式细胞仪法测定星形胶质细胞线粒体膜电位。(4)荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位,并采集图像。(5)采用Western Blotting法测定GLAST、GLT-1及GS蛋白的表达。4、统计分析检测数据输入计算机,用SPSS13.0进行数据的统计分析与处理。用单因素方差分析(ANOVA)比较组间的统计学差异,两两组间比较用SNK检验(Student’sNewman-Kenls, SNK),以P<0.05作为判定统计学显著性差异的标准。结果MTT检测结果显示,随NaAs02染毒浓度的增加,细胞活力下降,且各组间比较均有统计学意义。细胞形态学观察,对照组细胞呈多角形,胞体较大,生长密集；5μmol／L染砷组的细胞形态与对照组比较未见明显改变；10μmol／L染砷组细胞形态明显变化,细胞胞体折光性增强,细胞间隙增大,有少量细胞圆缩肿胀或脱壁；随着染毒浓度的增加,20μmol／L和30μmol／L染砷组细胞损伤程度进一步加重,细胞数量明显减少。流式细胞仪检测显示,各染毒组细胞的线粒体膜电位随染砷浓度的增加而降低。其中,20μmol／L和30μmol／L染砷组与对照组比较有显著性差异。各染毒组细胞内GLAST、GLT-1及GS蛋白的表达随着染砷浓度的增加而降低。各染毒组细胞内GLAST蛋白含量与对照组比较均有显著性差异,其中5μmol／L染砷组与10μmol／L、20μmol／L或30μmol／L染砷组比较亦有显著性差异。20μmol／L和30μmol／L染砷组细胞内GLT-1蛋白含量与对照组比较有显著性差异,5μmol／L或10μmol／L染砷组与30μmol／L染砷组比较差异也有统计学意义。20μmol／L和30gmol／L染砷组细胞内GS蛋白含量与对照组、5μmol／L或10μmol／L染砷组比较差异有统计学意义,20μmol／L染砷组和30μmol／L染砷组比较差异也有统计学意义。结论1、亚砷酸钠对AC具有明显的毒性作用,在5-30μmol／L的浓度范围内其毒性作用随染砷浓度的增加而增强。2、亚砷酸钠能够破坏线粒体功能,导致AC内线粒体膜电位下降。3、亚砷酸钠可引起体外培养AC内GLAST、GLT-1及GS蛋白表达的降低。