论文部分内容阅读
目的目前已有的研究表明,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）可选择性杀伤癌细胞,但研究发现许多癌细胞对TRAIL具有耐药性,如食管癌腺癌（Esop Hageal adenocarcinoma,EAC）就是非常典型的例证。EAC一般认为是由慢性胃食管反流病（Gastro-esophageal reflux disease,GERD）引起的食管炎症发展而来。在GERD发作期间,食管上皮长期暴露于胃酸中,胃酸中普遍含有十二指肠液,而十二指肠液主要成分胆汁盐可能是导致癌变的重要因素,在GERD病程中,许多细胞因子参与癌变过程,其中TRAIL就是重要的因子。本课题主要研究GERD事件如何影响EAC细胞中的TRAIL信号传导,并探讨TRAIL发生抗性的机制。方法将OE-19细胞分别给予急性和慢性刺激,包括酸性介质（p H 4.5）或酸性胆盐,在体外模拟GERD事件。Western blot检测TRAIL及其死亡受体（death receptor,DR）和诱骗受体（decoy receptor,DcR）的表达情况。采用凋亡素荧光技术检测细胞凋亡。为了确定TRAIL及其受体在细胞凋亡中的作用,本次实验将携带靶基因开放阅读框或sh RNA序列的质粒转染细胞。用空向量或负序列向量作为对照。结果（1）在正常生长条件下,OE-19细胞表达死亡受体DR4和三种诱骗受体DcR1、DcR2、OPG。在酸性暴露下,无论急性刺激还是慢性刺激,TRAIL配体及其第二死亡受体DR5均被激活表达,同时,DR4明显下降（P<0.05）,而诱骗受体保持不变。当胆盐与酸同时出现时,除了DR4的下调外,所有诱骗受体几乎全部消失（P<0.05）。（2）细胞凋亡检测结果显示,酸刺激下细胞生长良好,无明显改变,而有胆盐出现时,细胞凋亡明显上升,特别是酸/胆汁联合刺激时,细胞凋亡能够上升到60%以上（P<0.05）。但是,各种条件对细胞坏死没有明显影响。（3）使用载有特定sh RNA序列的p RS质粒转染食管腺癌OE-19细胞分别抑制TRAIL基因和DR5基因,western blot结果显示,转染细胞的TRAIL基因被有效地抑制（P<0.05）,运用转染后的细胞再去做GRED模拟实验,实验结果:敲掉TRAIL能减少酸性胆盐诱发的细胞凋亡（P<0.05）,同样的方式敲除DR5基因,western blot结果显示,DR5蛋白通过转染能够被有效地敲除（P<0.05）,然后,用转染后的细胞再去做GRED模拟实验,实验结果:敲除DR5基因的细胞在酸性胆汁刺激下细胞凋亡显著下降（P<0.05）。（4）以正常培养基中筛选出的以空质体转染的细胞为对照组,与对照组相比,使用载有靶基因序列的p CMV6质粒转染的细胞诱骗受体DcR1、DcR2和OPG均高表达（P<0.05）,而转染组细胞凋亡明显受到抑制,特别是DcR2转染组（P<0.05）。（5）与对照组即基础培养基刺激组比较,酸性胆盐组食管腺癌细胞中PARP蛋白被切割为两条蛋白,而与其他组未出现明显的PARP蛋白的切割（P<0.05）。结论（1）酸和胆汁均可诱导TRAIL和DR5的大量产生,但TRAIL只有在酸和胆汁同时存在的情况下才能迅速诱导OE-19细胞凋亡。（2）OE-19细胞中每个诱骗受体都参与TRAIL抗性的形成,但DcR2起主要作用。